山葡萄果皮cDNA文库构建及相关基因的克隆与表达

发布时间：2022-01-10 19:56

　　山葡萄浆果含有前花色苷、蛋白质及矿物质等营养元素,是具有很高经济价值的果树资源。本试验以山葡萄果皮为材料,成功构建了转色前果皮cDNA文库；并利用RACE方法克隆了CHS和CHI基因cDNA全长序列,进行了生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR技术对山葡萄果皮成熟的7个时期的基因表达进行了分析。主要研究结果如下：以山葡萄转色前果皮为试验材料,采用In-Fusion（?） SMARTer（?） Directional cDNA Library Construction技术构建了cDNA文库,经鉴定,文库初始滴度及扩增后滴度分别为1.15 ×106pfu.mL-1和2.86×109 pfu.mL-1,插入片段长度约为0.5-2.0 kb,平均0.9 kb,重组率高达100%。这些结果说明,本试验在山葡萄转色前果皮中成功构建了cDNA文库。为今后山葡萄功能基因分离克隆和功能基因组学研究建立了基础。通过RT-PCR结合快速扩增cDNA末端（RACE）方法,获得到了CHS和CHI基因的全长cDNA序列。生物信息学分析结果显示,这两个基因都具有完整的开放阅读框,其中,CHS基因的cDNA全长146... 

【文章来源】：延边大学吉林省 211工程院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 山葡萄简介
    1.2 山葡萄花色苷概要
        1.2.1 花色苷的结构及种类
        1.2.2 花色苷的生物合成途径
    1.3 实时荧光定量PCR技术简介
        1.3.1 荧光定量PCR技术原理
        1.3.2 实时荧光定量PCR的定量方法
            1.3.2.1 绝对定量法
            1.3.2.2 相对定量法
        1.3.3 实时荧光定量PCR技术的优点及应用
    1.4 研究的目的及意义
第二章 山葡萄转色前果皮cDNA文库的构建
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
            2.1.1.1 菌株、酶及生化试剂
            2.1.1.2 仪器设备
        2.1.2 实验方法
            2.1.2.1 山葡萄果皮总RNA的提取
            2.1.2.2 cDNA文库构建第一链的合成
            2.1.2.3 cDNA第二链的合成
            2.1.2.4 山葡萄ds cDNA的纯化及片段的分级分离
            2.1.2.5 ds cDNA与pSMART2IFD载体的连接
            2.1.2.6 重组质粒转化到E.coli
            2.1.2.7 初始文库滴度测定与文库的扩增
            2.1.2.8 文库插入片段长度与重组率检测
    2.2 结果与分析
        2.2.1 RNA提取结果
        2.2.2 ds cDNA的合成
        2.2.3 双链cDNA的分级分离
        2.2.4 cDNA文库的质量的评价
    2.3 讨论与结论
        2.3.1 讨论
        2.3.2 结论
第三章 CHS和CHI基因的克隆与分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
            3.1.1.1 载体、菌株及主要试剂
        3.1.2 试验方法
            3.1.2.1 引物的设计
            3.1.2.2 山葡萄总RNA的提取
            3.1.2.3 反转录cDNA第一链的合成
            3.1.2.4 PCR扩增目的基因片段
            3.1.2.5 PCR扩增产物的胶回收
            3.1.2.6 回收产物与载体连接
            3.1.2.7 大肠杆菌感受态的转化及测序
            3.1.2.8 RACE法cDNA末端的快速克隆
            3.1.2.9 目的基因cDNA全长序列的生物信息学分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 总RNA的提取与检测
        3.2.2 CHS基因的克隆与分析
            3.2.2.1 VamCHS cDNA全长序列的克隆与分析
            3.2.2.2 VamCHS编码蛋白质理化性状分析
            3.2.2.3 VamCHS蛋白的保守区分析
            3.2.2.4 VamCHS蛋白的亲水性分析
            3.2.2.5 VamCHS蛋白跨膜结构域分析
            3.2.2.6 VamCHS蛋白的信号肽及二级结构分析
            3.2.2.7 VamCHS蛋白的细胞定位分析
            3.2.2.8 VamCHS编码蛋白质的同源性及进化树
        3.2.3 CHI基因的克隆与分析
            3.2.3.1 VamCHI cDNA全长序列的克隆与分析
            3.2.3.2 VamCHI基因编码蛋白质理化性状分析
            3.2.3.3 VamCHI蛋白的保守区分析
            3.2.3.4 VamCHI蛋白的亲水性分析
            3.2.3.5 VamCHI蛋白的跨膜结构域分析
            3.2.3.6 VamCHI蛋白的信号肽预测及二级结构分析
            3.2.3.7 VamCHI蛋白的细胞定位分析
            3.2.3.8 VamCHI编码蛋白质的同源性及进化分析
    3.3 讨论与结论
        3.3.1 讨论
        3.3.2 结论
第四章 山葡萄着色过程中VamCHS和VamCHI的表达分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器与设备
        4.1.4 试验方法
            4.1.4.1 RNA的提取
            4.1.4.2 模版cDNA第一链的制备
            4.1.4.3 PCR引物设计及合成
            4.1.4.4 引物的普通PCR验证
            4.1.4.5 引物特异性的验证
            4.1.4.6 标准曲线的制备
            4.1.4.7 VamCHS和VamCHI基因的相对表达量分析
            4.1.4.8 数据处理
    4.2 结果与分析
        4.2.1 RNA的提取
        4.2.2 实时荧光定量PCR引物的常规PCR扩增
        4.2.3 实时荧光定量PCR标准曲线的制备
        4.2.4 VamCHS和VamCHI基因在果皮不同时期的表达水平分析
    4.3 讨论与结论
        4.3.1 讨论
        4.3.2 结论
第五章 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]山葡萄总RNA提取方法的比较[J]. 付阳,刘海峰,李娟,李翔国.  延边大学农学学报. 2013(04)
[2]观赏桃查尔酮合成酶基因的克隆及其序列分析[J]. 林玲,汤浩茹,陈清,鲁敏,贾慧峰,李英改,张晓楠.  园艺学报. 2012(03)
[3]植物花青素生物代谢调控[J]. 郭凤丹,王效忠,刘学英,夏晗,王兴军.  生命科学. 2011(10)
[4]中国山葡萄产业的发展及对策[J]. 宋润刚,艾军,李晓红,杨义明,沈育杰.  中外葡萄与葡萄酒. 2009(11)
[5]巨峰葡萄查尔酮异构酶基因克隆及表达分析[J]. 周军,姚泉洪,彭日荷,熊爱生,蔡斌,徐锦涛,金晓芬,陶建敏,章镇.  西北植物学报. 2009(09)
[6]实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用[J]. 袁亚男,刘文忠.  中国畜牧兽医. 2008(03)
[7]玉米根部酵母双杂交cDNA文库的构建及评价[J]. 崔红军,张军杰,黄玉碧.  分子植物育种. 2008(01)
[8]水中轮状病毒实时定量PCR外标准品的构建[J]. 胡秀华,何苗,刘丽,李丹,施汉昌.  环境科学. 2008(02)
[9]花青素研究进展[J]. 李娟娟.  中山大学研究生学刊(自然科学、医学版). 2007(02)
[10]花青素研究进展[J]. 李娟娟.  中山大学研究生学刊(自然科学、医学版). 2007 (02)

博士论文
[1]新城疫病毒的荧光定量RT-PCR检测及RNA干涉[D]. 岳华.西南大学 2006

硕士论文
[1]鸡马立克氏病病毒TaqMan探针双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用[D]. 张颖.内蒙古农业大学 2006



本文编号：3581322