苹果U6启动子的克隆及转录活性分析

发布时间：2022-10-10 21:48

　　CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物功能基因组学和植物分子育种研究中展现出广阔的应用前景,已应用于多种植物。目前该体系已在苹果（Malus×domestica）中实现基因编辑但进展较缓慢。U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体中驱动sgRNA转录的重要元件,其转录活性受亲缘关系和序列长度的影响。因此,筛选出合适的苹果内源U6启动子,将进一步优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系。‘金冠’苹果基因组中存在多条U6 snRNA,本研究选择E-value＜3e^-40的6条U6 snRNA,取其转录起始位点上游1 500 bp外加27 bp snRNA序列作为候选U6启动子进行比对分析。而后设计引物克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因（Firefly luciferase,LUC）的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片,通过检测荧光素酶活性对各候选U6启动子进行转录活性比较。筛选到一条转录活性最高的U6启动子后,对其从5’端进行不同长度截短,并进行转录活性分析。获... 

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
主要符号对照表
第一章 绪论
    1.1 基因组编辑体系
        1.1.1 CRISPR/Cas9 的原理
        1.1.2 CRISPR/Cas9 的发展
        1.1.3 CRISPR/Cas9 中的启动子
    1.2 植物启动子简介
        1.2.1 启动子的结构
        1.2.2 启动子的类别
        1.2.3 人工启动子
        1.2.4 启动子的功能分析
    1.3 U6启动子
        1.3.1 U6启动子的序列特征
        1.3.2 U6启动子的功能特性
        1.3.3 U6启动子的可修饰特性
    1.4 U6 启动子在CRISPR/Cas9 体系中的应用
    1.5 本研究的目的意义及研究内容
        1.5.1 目的意义
        1.5.2 研究内容
第二章 苹果U6启动子克隆及活性分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试验材料、试剂及仪器设备
        2.1.2 ‘金冠’苹果基因组DNA提取
        2.1.3 苹果U6启动子克隆
        2.1.4 苹果U6启动子生物信息分析
        2.1.5 苹果U6启动子表达载体构建
        2.1.6 本氏烟草和苹果愈伤组织中的瞬时表达
    2.2 结果与分析
        2.2.1 MdU6启动子序列分析
        2.2.2 MdU6启动子扩增产物鉴定
        2.2.3 MdU6启动子转录活性分析
    2.3 讨论与小结
        2.3.1 讨论
        2.3.2 小结
第三章 序列长度对苹果U6启动子转录活性的影响
    3.1 材料与方法
        3.1.1 Md U6-10-Ps和 At U6-1P的克隆
        3.1.2 Md U6-10-Ps及 At U6-1P的表达载体构建
        3.1.3 Md U6-10-Ps和 At U6-1P的转录活性分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 MdU6-10P序列元件分析
        3.2.2 MdU6-10P不同长度截短
        3.2.3 MdU6-10-Ps的扩增产物鉴定
        3.2.4 MdU6-10-Ps的转录活性分析
        3.2.5 Md U6-10-3P和 At U6-1P的转录活性比较
    3.3 结论与小结
        3.3.1 讨论
        3.3.2 小结
第四章 结论
参考文献
附录A
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征[J]. 王丽娟,龙俊宏,谢竹,吴柳,彭爱红,何永睿,龙琴,陈善春,邹修平.  园艺学报. 2019(04)
[2]植物基因启动子的克隆及分析的研究进展[J]. 马倩,马宝月,穆波,马慧.  中国农业文摘-农业工程. 2018(03)
[3]番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J]. 蒲艳,刘超,李继洋,阿尔祖古丽·塔什,胡燕,刘晓东.  中国农业科学. 2018(02)
[4]基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立[J]. 李继洋,雷建峰,代培红,姚瑞,曲延英,陈全家,李月,刘晓东.  作物学报. 2018(02)
[5]真核启动子研究进展[J]. 汤方,涂慧珍.  林业科技开发. 2015(02)
[6]植物诱导型启动子研究进展[J]. 孙芳芳,宋洪元.  南方园艺. 2014(02)
[7]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)
[8]高等植物胁迫诱导型启动子的研究进展[J]. 文添龙,刘雪梅,冀亚萍,俞嘉宁.  西北植物学报. 2014(01)
[9]本氏烟Ⅰ型启动子的克隆及其转录起始位点分析[J]. 李志英,牟红珍,高丁梅,丁国平,马婷,王盛.  中国生物工程杂志. 2014(01)
[10]植物组织特异性启动子研究[J]. 宋扬,周军会,张永强.  生物技术通报. 2007(06)

博士论文
[1]CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D]. 朱金洁.中国农业大学 2015
[2]CRISPR/Cas9基因定点突变体系构建与大豆抗旱相关gma-miR160功能研究[D]. 孙现军.西北农林科技大学 2015



本文编号：3690412