柑橘生长素响应因子ARF基因家族的表达分析及功能验证

发布时间：2022-12-11 05:28

　　生长素响应因子Auxin Response Factors（ARFs）在生长素信号转导途径中起着关键的作用,同时也参与了植物体内众多的生理生化过程。ARFs基因所编码的蛋白质可以与生长素响应基因启动子中特定的响应元件结合,从而调节植物的各个生长发育过程。本文旨在运用分子生物学手段系统性地分析柑橘中的ARFs基因家族的特征,并对一些关键基因进行功能分析。主要结果如下:1.本研究发现并证实了柑橘（甜橙）中共有19个不同的ARF基因,分别命名为CiARF1-CiARF19。该家族基因编码的蛋白质都具有非常典型的特征,包含三个不同的结构域:分别为氨基末端DNA结合结构域（DNA Binding Domain,DBD）、中间结构域（Middle Region,MR）、羧基末端的AUX/IAA结合结构域（C-terminal Domain,CTD）。本研究通过对柑橘中的ARF基因家族进行系统进化分析、染色体定位分析、编码蛋白的保守motif分析以及基因启动子区的顺式作用元件分析,从而更加全面地解析了柑橘中ARF基因家族的特征。2.通过定量PCR表达分析发现,CiARF在甜橙不同的组织和不同的发育阶... 

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 前言
    1.1 课题的提出
    1.2 文献综述
        1.2.1 ARF基因家族蛋白的结构
        1.2.2 在植物中ARF基因的激活、互作和调控机理
        1.2.3 ARFs在植物生长发育过程中的作用
        1.2.4 CRISPR/Cas9基因敲除原理及其应用
    1.3 本研究的目的和主要内容
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和载体质粒
        2.1.3 实验主要试剂和仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 生物信息分析方法
            2.2.1.1 柑橘ARF基因的鉴定与分离
            2.2.1.2 保守模体分析和亚细胞定位预测
            2.2.1.3 Ci ARFs的基因结构和染色体定位
            2.2.1.4 Ci ARFs的系统进化和启动子序列分析
        2.2.2 Ci ARFs基因表达分析相关方法
            2.2.2.1 总RNA的提取
            2.2.2.2 第一链c DNA合成
            2.2.2.3 实时荧光定量PCR检测
            2.2.2.4 定量引物设计
        2.2.3 Ci ARF16超表达载体的构建
            2.2.3.1 目的片段的扩增
            2.2.3.2 目的片段回收
            2.2.3.3 AT克隆
            2.2.3.4 目的片段重组引物设计
            2.2.3.5 线性化克隆载体制备
            2.2.3.6 一步法重组反应
            2.2.3.7 大肠杆菌转化
        2.2.4 CRISPR载体的构建
        2.2.5 质粒转化农杆菌感受态
        2.2.6 柑橘愈伤组织转化
        2.2.7 拟南芥遗传转化
3 结果与分析
    3.1 Ci ARFs基因的鉴定
    3.2 Ci ARFs基因系统进化和基因结构分析及基因注释
    3.3 Ci ARF蛋白的结构分析
    3.4 Ci ARF基因在染色体上的分布
    3.5 Ci ARF基因启动子区顺式模体预测
    3.6 Ci ARF基因在甜橙不同器官中表达情况分析
    3.7 甜橙果实成熟过程Ci ARF基因的表达情况分析
    3.8 经外源植物激素处理后Ci ARF基因表达分析
    3.9 Ci ARF8和Ci ARF16基因功能的验证
        3.9.1 构建CRISPR-Cas9载体
            3.9.1.1 目的片段与线性化载体重组连接
            3.9.1.2 农杆菌目的基因的PCR阳性检测
        3.9.2 柑橘愈伤组织的遗传转化
        3.9.3 鉴定转基因的愈伤组织
        3.9.4 Ci ARF16超表达载体的构建
            3.9.4.1 目的基因和质粒载体的酶切
            3.9.4.2 重组反应
            3.9.4.3 农杆菌目的基因PCR检测
        3.9.5 农杆菌介导的拟南芥转化
        3.9.6 拟南芥筛选培养及其阳性鉴定
        3.9.7 转基因拟南芥的表型统计分析
4 讨论
    4.1 Ci ARF在系统进化上的保守性
    4.2 Ci ARF表达模式的差异性
    4.3 CIRISP-Cas9在柑橘转化中存在的问题
    4.4 35S::Ci ARF16转基因拟南芥的表型变化及展望
参考文献
附录
    1. 实验所需培养基配方
        1.1 拟南芥转化培养基配方
        1.2 拟南芥筛选培养基配方
        1.3 伏令夏橙愈伤组织生长及转化培养基配方
    2. 研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]生长素反应因子作用机制研究进展[J]. 史梦雅,李阳,张巍,刘悦萍.  生物技术通报. 2012(08)
[2]植物生长素响应因子基因的研究进展[J]. 方佳,何勇清,余敏芬,郑炳松.  浙江农林大学学报. 2012(04)
[3]生长素响应因子与植物的生长发育[J]. 刘振华,于延冲,向凤宁.  遗传. 2011(12)
[4]生长素信号转导途径及参与的生物学功能研究进展[J]. 张娟.  生命科学研究. 2009(03)



本文编号：3718224