黄瓜CsSAMs基因启动子克隆及其与转录因子CsGT-3b的互作验证
发布时间：2022-12-18 15:18
S-腺苷甲硫氨酸合酶（SAMs）基因是目前众多逆境胁迫蛋白质组学和转录组学新发现的一个参与植物耐逆性的重要基因,其蛋白合成产物S-腺苷甲硫氨酸合酶（SAM）是一种极其重要的活性代谢物质,广泛参与逆境胁迫下核酸、蛋白质、磷脂等化合物的形成,同时还是多胺和乙烯合成的前体物质。然而,SAMs基因在逆境胁迫下的具体功能及其调控机制尚不清楚。本研究以盐敏感的黄瓜品种’津春2号’为材料,采用qRT-PCR方法分析了CsSAMs对不同逆境胁迫和激素的响应,克隆黄瓜CsSAMs基因启动子,并对其序列及功能进行分析验证,鉴定该启动子序列中响应盐胁迫的功能作用元件,并运用酵母单杂交技术筛选鉴定与该功能作用元件互作的上游转录因子,为深入阐明黄瓜CsSAMs基因在盐胁迫下的转录调控机理提供理论基础。主要研究结果如下:1.qRT-PCR分析表明,CsSAMs基因不仅能够响应盐胁迫,而且还受干旱、高温等胁迫条件的诱导。ABA、MeJA和GA3能上调CsSAMs基因表达,而SA处理抑制了该基因的表达。根据NCBI数据库获得了黄瓜CsSAMs基因5’上游序列,设计引物并克隆了 1742 bp启动子,生物信息学分析显示...
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
前言
第一章 文献综述
1 S-腺苷甲硫氨酸合酶研究进展
1.1 SAMs的结构特征及催化反应机制
1.2 SAMs的催化代谢机制
1.3 SAMs参与植物胁迫响应中的研究进展
2 植物启动子的研究进展
2.1 植物启动子结构与功能概述
2.2 植物启动子的分类及其特点
2.3 植物启动子的研究方法及功能检测
第二章 黄瓜CsSAMs基因表达及其启动子的克隆和序列分析
1 材料
1.1 试验材料
1.2 试验试剂及仪器
2 方法
2.1 黄瓜CsSAMs基因启动子的克隆
2.2 黄瓜叶片总RNA提取、cDNA合成以及qRT-PCR
3 结果与分析
3.1 黄瓜基因组DNA的提取
3.2 全长启动子片段的克隆
3.3 全长启动子片段的双酶切鉴定
3.4 黄瓜CsSAMs启动子序列的生物信息学分析
3.5 黄瓜叶片CsSAMs基因在不同逆境和激素处理下的表达模式分析
4 讨论
第三章 黄瓜CsSAMs启动子的功能分析
1 材料
1.1 试验材料
1.2 常用试验试剂及仪器
1.3 常用培养基及溶液制备
2 方法
2.1 不同片段长度CsSAMs启动子驱动GUS基因融合表达载体的构建
2.2 农杆菌介导的烟草叶片转化
2.3 GUS基因表达的组织化学检测
2.4 GUS酶活定量检测
2.5 农杆菌介导的瞬时表达分析
3 结果与分析
3.1 CsSAMs缺失启动子驱动GUS基因融合表达载体的构建
3.2 转基因烟草的再生与PCR检测
3.3 黄瓜CsSAMs启动子GUS组织化学染色分析
3.4 黄瓜CsSAMs启动子GUS酶活分析
3.5 瞬时表达验证GT-1元件对盐胁迫的响应
4 讨论
第四章 黄瓜CsSAMs启动子与上游转录因子的互作验证
1 材料
1.1 实验材料
1.2 常用试验试剂及仪器
1.3 常用培养基及溶液配制
2 方法
2.1 生物信息学方法预测黄瓜中能与GT-1元件互作的Trihelix转录因子
2.2 黄瓜Trihelix候选转录因子基因qRT-PCT鉴定
2.3 CsGT-3b转录因子生物信息学分析
2.4 酵母单杂交系统验证CsGT-3b转录因子与CsSAMs启动子GT-1元件的互作
2.5 黄瓜CsGT-3b转录因子与CsSAMs蛋白的亚细胞定位
3 结果与分析
3.1 系统发育树分析拟南芥AtGT-3b转录因子与黄瓜Trihelix转录因子家族关系
3.2 黄瓜Trihelix候选转录因子基因在盐胁迫下表达模式分析
3.3 黄瓜CsGT-3b蛋白的生物信息学分析
3.4 酵母单杂交体系验证
3.5 黄瓜CsGT-3b转录因子与CsSAMs蛋白的亚细胞定位
4 讨论
全文结论
附录
附表1 本研究所用引物总汇
附表2 MS培养基组分
附表3 10×SD培养基组分
附录4
附录4-1 pCAMBIA1303载体图谱
附录4-2 pEZS-NL载体图谱
附录4-3 酵母单杂交诱饵载体图谱
附录4-4 酵母单杂交文库载体图谱
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究[J]. 石翠翠,李晓旭,李晶岚,任亚楠,张福臻,黄占景,葛荣朝. 植物研究. 2014(03)
[2]陆地棉trihelix转录因子基因响应非生物胁迫表达谱分析[J]. 李月,孙杰,谢宗铭,李全胜,司爱君,陈受宜. 中国农业科学. 2013(09)
[3]外源Spd对盐胁迫下黄瓜SAMs基因表达的影响及SAMs蛋白的生物信息学分析[J]. 李斌,郭世荣,孙锦,陆晓民,李娟. 园艺学报. 2011(12)
[4]陆地棉耐盐相关基因GhSAMS的克隆及表达[J]. 周凯,宋丽艳,叶武威,王俊娟,王德龙,樊保香. 作物学报. 2011(06)
[5]糜子SAMS基因的克隆及其在干旱复水中的表达模式分析[J]. 林凡云,王士强,胡银岗,何蓓如. 作物学报. 2008(05)
[6]水稻（Oryza sativa L·）捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA的克隆和特性分析[J]. 向太和,王利琳,庞基良. 作物学报. 2005(09)
[7]植物逆境抗性相关转录因子的研究进展[J]. 桑新华,吴忠义,黄丛林,张潞生. 植物学通报. 2004(06)
[8]高等植物启动子及其应用研究进展[J]. 路静,赵华燕,何奕昆,宋艳茹. 自然科学进展. 2004(08)
[9]番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析[J]. 周晓红,陈晓光,张晓东,王亚楠,李林,习佳飞,胡建军. 第一军医大学学报. 2003(01)
[10]启动子克隆概述[J]. 孙晓红,陈明杰,潘迎捷. 食用菌学报. 2002(03)
硕士论文
[1]甜菜M14品系BvM14-SAMS2基因的克隆及盐、氧化胁迫下的应答[D]. 谷丹.黑龙江大学 2014
[2]黄瓜苦味物质生物合成调控相关转录因子的筛选与鉴定[D]. 张雷.南京农业大学 2013
[3]葡萄SAMS基因的克隆、原核表达及分析[D]. 鞠妍.辽宁师范大学 2013
[4]农杆菌介导SAMS基因的玉米自交系遗传转化与验证[D]. 杨政伟.西北农林科技大学 2011
[5]小麦S-腺苷甲硫氨酸代谢途径相关基因的抗旱节水功能分析[D]. 李昌澎.西北农林科技大学 2011
[6]GsSAMS基因对苜蓿的遗传转化及转基因新株系的培育[D]. 化烨.东北农业大学 2009
[7]玉米SAMS基因的克隆及表达分析[D]. 贾丽娜.河北农业大学 2008
本文编号：3722285
【文章页数】：93 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
前言
第一章 文献综述
1 S-腺苷甲硫氨酸合酶研究进展
1.1 SAMs的结构特征及催化反应机制
1.2 SAMs的催化代谢机制
1.3 SAMs参与植物胁迫响应中的研究进展
2 植物启动子的研究进展
2.1 植物启动子结构与功能概述
2.2 植物启动子的分类及其特点
2.3 植物启动子的研究方法及功能检测
第二章 黄瓜CsSAMs基因表达及其启动子的克隆和序列分析
1 材料
1.1 试验材料
1.2 试验试剂及仪器
2 方法
2.1 黄瓜CsSAMs基因启动子的克隆
2.2 黄瓜叶片总RNA提取、cDNA合成以及qRT-PCR
3 结果与分析
3.1 黄瓜基因组DNA的提取
3.2 全长启动子片段的克隆
3.3 全长启动子片段的双酶切鉴定
3.4 黄瓜CsSAMs启动子序列的生物信息学分析
3.5 黄瓜叶片CsSAMs基因在不同逆境和激素处理下的表达模式分析
4 讨论
第三章 黄瓜CsSAMs启动子的功能分析
1 材料
1.1 试验材料
1.2 常用试验试剂及仪器
1.3 常用培养基及溶液制备
2 方法
2.1 不同片段长度CsSAMs启动子驱动GUS基因融合表达载体的构建
2.2 农杆菌介导的烟草叶片转化
2.3 GUS基因表达的组织化学检测
2.4 GUS酶活定量检测
2.5 农杆菌介导的瞬时表达分析
3 结果与分析
3.1 CsSAMs缺失启动子驱动GUS基因融合表达载体的构建
3.2 转基因烟草的再生与PCR检测
3.3 黄瓜CsSAMs启动子GUS组织化学染色分析
3.4 黄瓜CsSAMs启动子GUS酶活分析
3.5 瞬时表达验证GT-1元件对盐胁迫的响应
4 讨论
第四章 黄瓜CsSAMs启动子与上游转录因子的互作验证
1 材料
1.1 实验材料
1.2 常用试验试剂及仪器
1.3 常用培养基及溶液配制
2 方法
2.1 生物信息学方法预测黄瓜中能与GT-1元件互作的Trihelix转录因子
2.2 黄瓜Trihelix候选转录因子基因qRT-PCT鉴定
2.3 CsGT-3b转录因子生物信息学分析
2.4 酵母单杂交系统验证CsGT-3b转录因子与CsSAMs启动子GT-1元件的互作
2.5 黄瓜CsGT-3b转录因子与CsSAMs蛋白的亚细胞定位
3 结果与分析
3.1 系统发育树分析拟南芥AtGT-3b转录因子与黄瓜Trihelix转录因子家族关系
3.2 黄瓜Trihelix候选转录因子基因在盐胁迫下表达模式分析
3.3 黄瓜CsGT-3b蛋白的生物信息学分析
3.4 酵母单杂交体系验证
3.5 黄瓜CsGT-3b转录因子与CsSAMs蛋白的亚细胞定位
4 讨论
全文结论
附录
附表1 本研究所用引物总汇
附表2 MS培养基组分
附表3 10×SD培养基组分
附录4
附录4-1 pCAMBIA1303载体图谱
附录4-2 pEZS-NL载体图谱
附录4-3 酵母单杂交诱饵载体图谱
附录4-4 酵母单杂交文库载体图谱
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗逆基因AtRPK1启动子关键顺式作用元件的研究[J]. 石翠翠,李晓旭,李晶岚,任亚楠,张福臻,黄占景,葛荣朝. 植物研究. 2014(03)
[2]陆地棉trihelix转录因子基因响应非生物胁迫表达谱分析[J]. 李月,孙杰,谢宗铭,李全胜,司爱君,陈受宜. 中国农业科学. 2013(09)
[3]外源Spd对盐胁迫下黄瓜SAMs基因表达的影响及SAMs蛋白的生物信息学分析[J]. 李斌,郭世荣,孙锦,陆晓民,李娟. 园艺学报. 2011(12)
[4]陆地棉耐盐相关基因GhSAMS的克隆及表达[J]. 周凯,宋丽艳,叶武威,王俊娟,王德龙,樊保香. 作物学报. 2011(06)
[5]糜子SAMS基因的克隆及其在干旱复水中的表达模式分析[J]. 林凡云,王士强,胡银岗,何蓓如. 作物学报. 2008(05)
[6]水稻（Oryza sativa L·）捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA的克隆和特性分析[J]. 向太和,王利琳,庞基良. 作物学报. 2005(09)
[7]植物逆境抗性相关转录因子的研究进展[J]. 桑新华,吴忠义,黄丛林,张潞生. 植物学通报. 2004(06)
[8]高等植物启动子及其应用研究进展[J]. 路静,赵华燕,何奕昆,宋艳茹. 自然科学进展. 2004(08)
[9]番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析[J]. 周晓红,陈晓光,张晓东,王亚楠,李林,习佳飞,胡建军. 第一军医大学学报. 2003(01)
[10]启动子克隆概述[J]. 孙晓红,陈明杰,潘迎捷. 食用菌学报. 2002(03)
硕士论文
[1]甜菜M14品系BvM14-SAMS2基因的克隆及盐、氧化胁迫下的应答[D]. 谷丹.黑龙江大学 2014
[2]黄瓜苦味物质生物合成调控相关转录因子的筛选与鉴定[D]. 张雷.南京农业大学 2013
[3]葡萄SAMS基因的克隆、原核表达及分析[D]. 鞠妍.辽宁师范大学 2013
[4]农杆菌介导SAMS基因的玉米自交系遗传转化与验证[D]. 杨政伟.西北农林科技大学 2011
[5]小麦S-腺苷甲硫氨酸代谢途径相关基因的抗旱节水功能分析[D]. 李昌澎.西北农林科技大学 2011
[6]GsSAMS基因对苜蓿的遗传转化及转基因新株系的培育[D]. 化烨.东北农业大学 2009
[7]玉米SAMS基因的克隆及表达分析[D]. 贾丽娜.河北农业大学 2008
本文编号：3722285
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