羽衣甘蓝PCNA基因克

发布时间：2023-02-09 07:14

　　增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)作为一种真核生物中广泛存在的蛋白质,通过其特殊的三级结构,与DNA结合并且募集相应的蛋白,参与DNA复制、DNA修复以及细胞周期等多种过程。羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)属于十字花科芸薹属,具有较强的耐寒性和观赏性,是秋冬季节城市绿化的重要景观植物。本研究以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为研究材料,分离羽衣甘蓝PCNA1和PCNA2基因全长并进行序列分析；利用Gateway技术构建带有GFP标签的表达载体,进行PCNA亚细胞定位研究；通过构建原核表达载体,原核表达纯化获得PCNA蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体；对羽衣甘蓝不同组织及不同发育阶段的柱头进行蛋白检测,分析PCNA蛋白表达的时空性。这些研究为PCNA的生物学功能研究奠定了基础。主要的研究结果如下：1、通过RT-PCR和RACE克隆技术从羽衣甘蓝柱头中分离得到了PCNA1和PCNA2基因。PCNA1基因全长为1127bp,其中包含5’非翻译区126bp,3’非翻译区209bp,开放...

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 PCNA的简介
    1.2 PCNA的结构
    1.3 PCNA的表达调控
    1.4 PCNA参与DNA复制
    1.5 PCNA参与DNA修复
    1.6 PCNA参与细胞周期
    1.7 研究的目的与意义
2 PCNA基因的克隆及序列分析
    2.1 材料
        2.1.1 主要试验仪器
        2.1.2 主要试验试剂
        2.1.3 试验试剂配制
    2.2 方法
        2.2.1 柱头总RNA提取
        2.2.2 PCNA基因的RT-PCR
        2.2.3 RACE克隆
        2.2.4 生物信息学分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 柱头总RNA的提取
        2.3.2 PCNA基因RT-PCR
        2.3.3 PCNA的RACE克隆
        2.3.4 生物信息学分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
3 PCNA表达载体构建及亚细胞定位
    3.1 材料
        3.1.1 主要试验试剂
        3.1.2 实验试剂配制
    3.2 方法
        3.2.1 转基因载体的构建
        3.2.2 原生质体亚细胞定位
    3.3 结果与分析
        3.3.1 转基因载体的构建
        3.3.2 原生质亚细胞定位
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
4 PCNA原核表达载体的构建及蛋白表达纯化
    4.1 材料
        4.1.1 试验试剂配制
    4.2 方法
        4.2.1 原核表达纯化
    4.3 结果与分析
        4.3.1 PCNA原核表达纯化
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
5 PCNA多克隆抗体制备及蛋白表达分析
    5.1 材料
        5.1.1 主要试验试剂及仪器
        5.1.2 试验试剂配制
    5.2 方法
        5.2.1 PCNA免疫抗体制备
        5.2.2 蛋白样品制备
        5.2.3 SDS-PAGE电泳
        5.2.4 转膜
        5.2.5 免疫印迹反应
    5.3 结果与分析
        5.3.1 抗体效价检测
        5.3.2 蛋白样品制备
        5.3.3 PCNA在组织中表达情况检测
        5.3.4 PCNA在不同发育时期的柱头表达情况检测
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢



本文编号：3738454