糙皮侧耳漆酶转录因子基因ltf4的克隆及功能分析

发布时间：2023-03-05 11:50

　　糙皮侧耳作为一种大型木腐真菌,通过分泌漆酶来降解培养料中的木质素。在糙皮侧耳基因组中共有12条假定的漆酶编码基因,其中,poxc(lacc10)基因的编码产物是一种典型的糙皮侧耳漆酶,并且其表达量在糙皮侧耳整个生长发育过程中均很高。ltf4是通过应用酵母单杂交技术,利用糙皮侧耳poxc核心启动子序列构建诱饵菌株,从子实体cDNA文库中得到的基因。本文以糙皮侧耳新831菌株作为研究对象,对ltf4基因进行了如下研究:扩增ltf4基因的CDS区并对其进行生物信息学分析;利用反转录PCR(RT-PCR)对ltf4和poxc基因进行表达模式分析;对ltf4基因进行原核异源表达及蛋白纯化;利用凝胶阻滞实验(EMSA)检测LTF4与poxc核心启动子序列的互作情况;构建ltf4基因的过表达和反义沉默载体,为ltf4基因功能的体内分析做准备。本文主要结论如下:1、以糙皮侧耳子实体期cDNA为模板进行PCR,成功克隆得到了糙皮侧耳ltf4基因的CDS区,ltf4基因CDS区长1,608 bp,编码产物长535 aa。生物信息学分析结果显示:LTF4与糙皮侧耳PC15中某假定蛋白(KDQ29010.1)...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
第一章 文献综述
    1.1 糙皮侧耳漆酶
        1.1.1 糙皮侧耳漆酶的酶学性质
        1.1.2 糙皮侧耳漆酶的基因表达
    1.2 真菌转录因子研究
        1.2.1 转录因子结构
        1.2.2 转录因子的研究方法
            1.2.2.1 凝胶阻滞
            1.2.2.2 DNase I足迹法
            1.2.2.3 染色质免疫共沉淀技术
    1.3 基因功能的研究方法
        1.3.1 基因敲除
        1.3.2 RNA干扰
        1.3.3 反义RNA技术
        1.3.4 超表达
第二章 引言
    2.1 研究依据及意义
    2.2 实验技术路线
第三章 糙皮侧耳ltf4 基因的克隆及生物信息学分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株和载体
        3.1.2 培养基
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 糙皮侧耳子实体期总RNA提取
            3.2.1.1 利用Trizol试剂提取糙皮侧耳总RNA
            3.2.1.2 总RNA质量检测方法
        3.2.2 cDNA第一条链的合成
        3.2.3 糙皮侧耳ltf4基因全长CDS区的扩增
        3.2.4 目的产物的回收纯化
        3.2.5 目的基因连接T载体
            3.2.5.1 目的基因3’端加“A”
            3.2.5.2 目的基因与T载体连接
        3.2.6 连接产物转化感受态细胞
            3.2.6.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备
            3.2.6.2 转化感受态细胞
        3.2.7 筛选阳性转化子
        3.2.8 糙皮侧耳ltf4 基因生物信息学分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 糙皮侧耳ltf4 基因全长CDS区的扩增
            3.3.1.1 ltf4 基因比对结果
            3.3.1.2 糙皮侧耳子实体期总RNA提取及c DNA合成
            3.3.1.3 扩增糙皮侧耳ltf4基因的全长CDS区
            3.3.1.4 ltf4 基因CDS区测序及分析
        3.3.2 糙皮侧耳LTF4 功能预测及结构分析
    3.4 本章小结
第四章 ltf4 基因的原核表达及蛋白纯化
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株和质粒
        4.1.2 培养基
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 仪器
        4.1.5 溶液配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 原核表达载体pEASY-E2-ltf4 的构建
            4.2.1.1 PCR产物与pEASY-E2 表达载体连接
            4.2.1.2 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞
            4.2.1.3 阳性克隆的检测
        4.2.2 原核表达载体pEASY-E2-ltf4 转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞
        4.2.3 ltf4 基因的诱导表达
            4.2.3.1 菌落PCR鉴定阳性转化子
            4.2.3.2 诱导表达
            4.2.3.3 SDS-PAGE检测
        4.2.4 蛋白纯化
        4.2.5 目的蛋白的浓缩
    4.3 实验结果
        4.3.1 原核表达载体pEASY-E2-ltf4 的构建
        4.3.2 原核表达及SDS-PAGE分析
        4.3.3 蛋白纯化及浓缩
    4.4 本章小结
第五章 糙皮侧耳漆酶基因poxc及其转录因子基因ltf4 的表达模式分析
    5.1 实验材料
        5.1.1 菌株
        5.1.2 培养基
        5.1.3 主要试剂
        5.1.4 主要仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 糙皮侧耳的栽培
        5.2.2 提取糙皮侧耳不同生长时期的总RNA
        5.2.3 cDNA第一条链的合成
        5.2.4 半定量RT-PCR
            5.2.4.1 设计引物
            5.2.4.2 PCR扩增
    5.3 实验结果
        5.3.1 糙皮侧耳漆酶基因poxc表达模式分析
        5.3.2 糙皮侧耳ltf4 基因表达模式分析
    5.4 本章小结
第六章 LTF4 与漆酶基因poxc核心启动子区的体外互作研究
    6.1 实验材料
        6.1.1 菌株与质粒
        6.1.2 培养基
        6.1.3 主要试剂
        6.1.4 仪器
        6.1.5 溶液配制
    6.2 实验方法
        6.2.1 探针的扩增
            6.2.1.1 提取糙皮侧耳新831 基因组DNA
            6.2.1.2 PCR扩增糙皮侧耳漆酶poxc核心启动子区域
            6.2.1.3 PCR产物的纯化p MD19-T simple载体连接
            6.2.1.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
            6.2.1.5 阳性克隆的筛选与鉴定
            6.2.1.6 测序结果分析
        6.2.2 双链探针的标记
            6.2.2.1 阳性质粒的酶切
            6.2.2.2 待标记探针的纯化
            6.2.2.3 DIG标记双链探针
            6.2.2.4 已标探针的纯化
            6.2.2.5 已标探针的效率检测
        6.2.3 结合反应
        6.2.4 电泳
        6.2.5 转膜
        6.2.6 免疫检测
    6.3 实验结果
        6.3.1 糙皮侧耳漆酶基因poxc核心启动子区域的扩增
        6.3.2 阳性克隆的筛选
        6.3.3 pMD19-T Simple-poxc407 质粒的酶切及poxc407 片段的回收
        6.3.4 DIG标记双链探针的纯化
        6.3.5 已标探针的效率检测
        6.3.6 凝胶阻滞实验
    6.4 本章小结
第七章 糙皮侧耳ltf4 基因过表达载体和反义沉默载体的构建
    7.1 实验材料
        7.1.1 菌株和质粒
        7.1.2 培养基
        7.1.3 主要试剂
        7.1.4 仪器
    7.2 实验方法
        7.2.1 真核表达载体构建方法与策略
        7.2.2 糙皮侧耳基因ltf4 过表达与反义沉默片段的克隆
            7.2.2.1 引物设计
            7.2.2.2 ltf4-XbaI片段的PCR扩增
        7.2.3 ltf4-Xba I片段TA克隆
            7.2.3.1 ltf4-XbaI片段3’端加“A”
            7.2.3.2 ltf4-XbaI片段与p MD19-Tsimple载体连接
        7.2.4 连接产物转化感受态细胞
        7.2.5 阳性转化子的筛选
        7.2.6 糙皮侧耳过表达与反义沉默表达载体的构建
            7.2.6.1 pMD19-T-ltf4-XbaI重组质粒与p Po-GPD表达载体的酶切、酶连
            7.2.6.2 连接产物转化感受态细胞
            7.2.6.3 阳性克隆的筛选与鉴定
            7.2.6.4 测序结果分析
    7.3 结果与分析
        7.3.1 糙皮侧耳ltf4-XbaI片段的克隆
        7.3.2 糙皮侧耳ltf4 过表达与反义沉默载体的构建
    7.4 本章小结
第八章 农杆菌介导真核表达载体转化糙皮侧耳
    8.1 实验材料
        8.1.1 菌种和质粒
        8.1.2 培养基
        8.1.3 主要试剂
        8.1.4 仪器
        8.1.5 溶液配制
    8.2 实验方法
        8.2.1 过表达及反义沉默载体转化农杆菌EHA105
        8.2.2 筛选阳性转化子
        8.2.3 过表达及反义沉默载体转化糙皮侧耳
            8.2.3.1 糙皮侧耳潮霉素致死浓度的探究
            8.2.3.2 糙皮侧耳菌丝块的培养
            8.2.3.3 农杆菌的培养
            8.2.3.4 农杆菌与糙皮侧耳共培养
            8.2.3.5 糙皮侧耳转化子的初筛与复筛
    8.3 结果与分析
        8.3.1 过表达及反义沉默载体转化农杆菌EHA105
        8.3.2 糙皮侧耳潮霉素致死浓度的探究
        8.3.3 糙皮侧耳转化子的初筛与复筛
    8.4 本章小结
第九章 结论与讨论
    9.1 主要结论
    9.2 讨论
    9.3 后续实验设想
参考文献
英文摘要



本文编号：3756140