香雪兰类黄酮代谢相关bHLH转录因子基因的克隆及其功能鉴定

发布时间：2023-05-10 05:22

　　花色的改良一直是植物学家和园艺学家关注的重点,其中类黄酮是影响花色形成最主要的物质。类黄酮是植物体内一类重要的次生代谢产物,其合成途径受由MYB蛋白、bHLH蛋白以及WD40蛋白形成的MBW复合物的调控。针对于调控类黄酮合成的bHLH蛋白的研究虽然在几种不同物种中已有报道,但是其功能分化及作用方式却非常复杂,对其研究也不是十分清晰,且这些研究大多集中于双子叶植物,而对于单子叶植物的研究却寥寥无几。香雪兰(Fressia hybrida),鸢尾科香雪兰属多年生球根草本花卉,世界十大切花之一,颜色丰富艳丽,是研究花色的良好材料。本研究选取红花香雪兰为实验材料,克隆出两个参与调控类黄酮合成的bHLH转录因子基因,分别命名为FhGL3L和FhTT8L。通过生物信息学分析、转基因拟南芥分析和原生质体瞬时转染实验等,对其基因功能进行了详细的解析。主要研究方法及具体研究结果如下:1.FhGL3L和FhTT8L的克隆及生物信息学分析根据香雪兰转录组测序结果,通过RACE方法成功克隆到香雪兰FhGL3L和FhTT8L的全长cDNA序列。Fh GL3L序列长度为2437bp,开放阅读框为2061bp,编码...

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
引言
    1.颜色产生的机制
    2.影响花色形成的因素
        2.1 影响花色形成的色素类物质
        2.2 影响花色形成的其它因素
    3.类黄酮合成途径及关键基因
        3.1 类黄酮合成途径及关键酶
        3.2 类黄酮合成相关转录因子
    4.调控类黄酮合成的bHLH转录因子
    5.本研究目的意义与内容
材料与方法
    1.实验材料
        1.1 植物材料及培养方法
        1.2 质粒及菌种
        1.3 主要试剂
        1.4 主要试剂配制方法
        1.5 主要仪器设备
        1.6 引物合成
    2.实验方法
        2.1 基因克隆
        2.2 生物信息学分析
        2.3 花色苷及原花青素相对含量测定
        2.4 转化拟南芥及转基因植株筛选
        2.5 Real Time-qPCR及基因表达量分析
        2.6 原生质体瞬时转染
结果及分析
    1.两个香雪兰bHLH转录因子基因的克隆及生物信息学分析
        1.1 FhbHLHs基因的克隆
        1.2 FhbHLHs的生物信息学分析
    2.FhbHLHs基因表达模式与香雪兰花色苷及原花青素（PAs）积累模式相关性分析
        2.1 红花、白花香雪兰盛开时期花朵总花色苷含量测定
        2.2 红花香雪兰花朵发育不同时期花色苷及原花青素积累模式分析
        2.3 红花香雪兰不同组织花色苷及原花青素积累模式分析
        2.4 FhTT8L和FhGL3L基因在红花香雪兰中表达模式分析
    3.过量表达FhGL3L基因影响拟南芥花色苷积累及拟南芥叶片表面表皮毛发生
        3.1 过量表达载体的构建
        3.2 植物转化及转基因阳性植株的筛选
        3.3 过量表达FhGL3L基因影响拟南芥花色苷积累
        3.4 过量表达FhGL3L基因影响拟南芥茎和叶面表皮毛发生
    4.瞬时表达FhTT8L影响拟南芥花色苷及原花青素合成相关结构基因的表达
        4.1 瞬时表达载体的构建及质粒的大量提取
        4.2 瞬时表达FhTT8L及Real time-qPCR分析
    5.FhTT8L、FhGL3L与AtMYBs互作
        5.1 FhTT8L和FhGL3L转录激活能力验证
        5.2 FhTT8L、FhGL3L与AtMYBs互作验证
    6.FhTT8L、FhGL3L与AtPAP1共转启动AtDFR的表达
    7.FhGL3L激活能力的丧失导致转基因拟南芥表皮毛的缺失
    8.FhTT8L、FhGL3L截短区域功能验证
        8.1 载体构建及激活能力验证
        8.2 FhbHLHs N端保守结构域MIR与MYB互作
        8.3 C端结构域参与形成同源二聚体
讨论
    1.FhGL3L和FhTT8L是香雪兰中的两个bHLHs转录因子
    2.FhGL3L和FhTT8L参与调控类黄酮物质的合成
    3.过表达FhGL3L抑制拟南芥茎与叶面表皮毛发生
    4.FhGL3L和FhTT8L在转基因拟南芥中的作用模式
结论与创新点
参考文献
致谢



本文编号：3813118