柑橘铝毒响应因子ALS3和CAD互作蛋白及表达模式分析

发布时间：2023-11-28 17:34

　　柑橘属于亚热带常绿果树,是我国重要的经济果树之一,主要种植于多为酸性土壤的热带、亚热带和温带地区,容易遭受铝(Al)胁迫危害。通过前人研究报道及我们课题组前期蛋白质组学的研究,发现铝敏感蛋白3(ALS3)和肉桂醇脱氨酶(CAD)是柑橘根系中Al胁迫响应的两个关键蛋白,目前对于Al胁迫下ALS3和CAD这两个蛋白的作用机理尚未清楚。本研究以耐铝的雪柑和不耐铝的酸柚为材料,研究了Al毒下雪柑和酸柚生物量、光合速率、根系木质素含量等生理指标的变化;利用酵母双杂交试验筛选ALS3和CAD的互作蛋白,并利用双分子荧光互补(BiFC)、Western杂交和RT-qPCR等技术进一步验证候选互作蛋白的亚细胞定位和表达模式。得到的主要研究结果如下:(1)Al胁迫通过增加柑橘根系活性氧胁迫和木质化进而影响雪柑和酸柚的生长,研究结果表明Al毒害下,酸柚和雪柑的Fv/Fm和Fv’/Fm’值、ETR值均下降,而qNP、NPQ值增加,说明Al毒下雪柑和酸柚的光能利用率较低;此外Al处理增加了雪柑和酸柚根系的H₂O₂和木质素含量,与对照相比,酸柚根系的生物量明显下降且根...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第一章 引言
    1 自然界中的铝
    2 Al对植物的生长发育影响
        2.1 Al对植物的作用
        2.2 植物Al毒害的症状
        2.3 Al毒害对植物细胞的生理生化影响
    3 Al毒害对植物蛋白质表达的影响
        3.1 蛋白质互作研究进展
        3.2 Al毒害对ALS3和CAD蛋白的影响
    4 研究意义
    5 研究内容及技术路线
        5.1 研究内容
        5.2 技术路线
第二章 材料与方法
    1.材料
        1.1 实验材料
        1.2 试剂与仪器
    2 方法
        2.1 柑橘苗的处理和培养
        2.2 叶片光合作用和呼吸速率及叶绿素荧光的测定
        2.3 柑橘根叶电导率、H2O2 和超氧阴离子产生的测定
        2.4 柑橘生物量和AL元素含量的测定
        2.5 根系木质素含量的测定
        2.6 柑橘根系总RNA及总蛋白提取
        2.7 ALS3和CAD的 RT-qPCR分析
        2.8 ALS3 蛋白的Western Blotting检测
        2.9 诱饵载体pGBKT7-ALS3与pGBKT7-CAD的构建
        2.10 猎物载体pGADT7 与酸柚c DNA文库的构建
        2.11 ALS3 诱饵载体、CAD诱饵载体互作基因的筛选
        2.12 BiFC验证互作的准确性
        2.13 ALS3和CAD及其互作蛋白基因的荧光定量PCR分析
        2.14 试验设计和统计分析
第三章 结果与分析
    3.1 Al处理对雪柑和酸柚根、茎、叶生物量和Al元素含量的影响
    3.2 Al处理对雪柑和酸柚生长和叶绿素荧光的影响
    3.3 Al处理对雪柑和酸柚根叶H2O2 和超氧阴离子产生的影响
    3.4 Al处理对根木质素含量的影响
    3.5 Al处理对柑橘ALS3和CAD基因的表达
    3.6 雪柑和酸柚根系ALS3的Western Blotting分析
    3.7 ALS3 基因、CAD基因的克隆及酵母双杂载体构建
    3.8 阴性和阳性对照的检测结果
    3.9 诱饵蛋白毒性和自激活检测的分析
    3.10 酸柚酵母表达文库双链c DNA纯化的分析
    3.11 酸柚酵母表达文库滴定测定的分析
    3.12 酵母融合检测及阳性克隆菌落筛选结果
    3.13 阳性克隆测序及序列比对结果
    3.14 酵母文库质粒与诱饵载体的一对一验证
    3.15 BiFC载体构建及共聚焦显微镜检测结果
    3.16 Al处理下ALS3和CAD互作蛋白基因的RT-qPCR分析
第四章 讨论
    4.1 Al处理对雪柑和酸柚生长的影响
    4.2 Al毒害抑制光合的可能原因
    4.3 Al毒损害柑橘根系、抑制雪柑和酸柚的生长的原因
    4.4 Al毒害对柑橘根系ALS3和CAD蛋白表达模式的影响
    4.5 筛选蛋白的生物学功能的分析
第五章 总结与展望
参考文献
在读硕士学位期间发表的学术论文
致谢



本文编号：3868603