利用CRISPR/Cas9系统构建葡萄基因敲除载体及遗传转化

发布时间：2024-03-06 22:37

　　CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)系统作为一种新的基因编辑工具,其操作简单、成本低、周期短,正在被广泛研究和应用,目前已经成功实现了在水稻、小麦、拟南芥、本生烟草、苹果、香蕉、小鼠等生物中的基因定点编辑。近两年CRISPR系统在葡萄上也得到了成功的应用,但尚不成熟。本试验利用CRISPR/Cas9技术对‘无核白’葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson Seedless)的VvOEE2基因和VvPDS1基因进行定点敲除,以期望获得基因编辑的‘无核白’葡萄植株。主要结果如下:1.利用双子叶植物基因编辑载体pP1C.4和pYLCRISPR/Cas9成功构建重组质粒:pP1C.4-OEE2-2、pP1C.4-PDS1-1、pP1C.4-PDS1-2、pYL-OEE2-15,利用这四个重组质粒分别转化‘无核白’葡萄体细胞胚,经过筛选培养,依次获得80、0、63、13株抗性植株,通过对抗性植株的靶序列测序分析,并未检测到靶点的突变。2.利用基因编辑载体pJim19...

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 基因编辑技术
    1.2 CRISPR/Cas系统
        1.2.1 CRISPR/Cas系统的基本结构
        1.2.2 CRISPR/Cas系统的作用方式
        1.2.3 CRISPR/Cas系统的研究历史
        1.2.4 CRISRP/Cas系统的应用
    1.3 目的基因的生物学功能
        1.3.1 OEE2(oxygen-evolving enhancer protein2)基因
        1.3.2 PDS(phytoene dehydrogenase)基因
    1.4 研究的目的和意义
第二章 利用pP1C.4、pYLCRISPR/Cas9载体构建重组质粒转化无核白葡萄体细胞胚及鉴定
    2.1 试验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株与载体
        2.1.3 试验试剂及其配置
        2.1.4 仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 VvOEE2和VvPDS1基因靶序列的扩增与比对
        2.2.2 构建重组质粒载体
        2.2.3 农杆菌的转化
        2.2.4 农杆菌介导葡萄体细胞胚的遗传转化
        2.2.5 阳性植株的鉴定检测
    2.3 结果与分析
        2.3.1 VvOEE2基因、VvPDS1基因靶序列的扩增
        2.3.2 靶序列的比对
        2.3.3 sgRNA靶点选择以及引物设计
        2.3.4 利用载体一pP1C.4构建重组质粒载体
        2.3.5 利用载体二pYLCRISPR/Cas9构建重组质粒载体
        2.3.6 转化葡萄植株的检测
    2.4 讨论
第三章 利用pCambia1300、pJim19载体构建重组质粒瞬时转化‘无核白’葡萄及鉴定
    3.1 试验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株与载体
        3.1.3 试验试剂及其配置
        3.1.4 仪器设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 构建重组质粒载体
        3.2.2 瞬时转化葡萄原生质体
        3.2.3 农杆菌介导的葡萄叶片瞬时转化
        3.2.4 瞬时转化葡萄的检测
    3.3 结果与分析
        3.3.1 靶点的选择和引物设计
        3.3.2 酶切pAtU6-M载体
        3.3.3 双酶切载体pCambia1300、pJim19与pAtU6-sgRNAs连接
        3.3.4 质粒测序结果
        3.3.5 葡萄原生质体瞬时转化
        3.3.6 葡萄叶片瞬时转化
    3.4 讨论
第四章 结论
参考文献
致谢
个人简介



本文编号：3920984