甘蓝原生质体制备体系优化及瞬时转化体系的建立

发布时间：2025-01-01 08:19

　　 为研究甘露醇浓度、酶解时间、离心力大小和不同外植体对原生质体产量和活力的影响,采用正交试验方案对甘蓝原生质体制备体系进行了优化,并建立了甘蓝原生质体的瞬时转化体系,同时利用该体系对甘蓝CRISPR/Cas9基因编辑系统进行了初步研究。结果表明:以下胚轴为材料,酶液组成为1%纤维素酶+0.5%离析酶+0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L MES+1 mmol/L CaCl₂+0.1%BSA+5 mmol/Lβ-巯基乙醇,26℃,60 r/min,黑暗酶解6 h后,用2 115 r/min离心5 min收集细胞,可获得高质量的原生质体,原生质体产量约为3.0×10～6个/g,活力约为90.9%;另外,在20%PEG4000介导下,将带有绿色荧光蛋白的载体（PYBA 1132）分别转入从甘蓝下胚轴、子叶、叶球分离获得的原生质体中,在荧光显微镜下观察到GFP绿色荧光信号,转化效率分别为43%,35%,19%,表明下胚轴分离获得的原生质体最适于瞬时转化。同时以下胚轴分离获得的原生质体为受体,分别转化线粒体特异表达载体COX和质体特异表达载体969,也观察到了荧光信号...

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【部分图文】：

图1 甘露醇各水平的产量和活力均值LSD比较

进一步对各因素各水平间的处理结果进行LSD多重比较分析显示,甘露醇作为渗透压稳定剂,过高或过低均会对原生质体数量和活力产生影响,当甘露醇浓度达到0.6mol/L时,分离得到的原生质体数量和活力均为最好,显著高于其他2组(图1);由图2所示,随着酶解时间的增加,分离得到的原生质体....

图2 酶解时间各水平的产量和活力均值LSD比较

图1甘露醇各水平的产量和活力均值LSD比较2.2优化条件下原生质体制备

图3 离心速度各水平的产量和活力均值LSD比较

通过四因素三水平的正交试验设计,获得了影响原生质体制备的4个因素的最佳组合,因试验设计中没有最佳组合,故对试验结果进行验证,以甘蓝下胚轴为外植体,在含有0.6mol/L甘露醇的酶解液中黑暗酶解6h,以2115r/min的离心速度收集细胞,对分离获得的原生质体数量和活力进行....

图4 外植体各水平的产量和活力均值LSD比较

图3离心速度各水平的产量和活力均值LSD比较图5最佳条件下分离获得的原生质体形态和活力

本文编号：4022307