L-天冬氨酸α-脱羧酶催化失活相关分子机制的研究

发布时间：2020-04-01 22:24

【摘要】：氨基酸脱羧酶(Amino acid decarboxylase)是一类催化氨基酸脱去羧基生成小分子氨基酸或者生物胺的裂解酶的总称,其产物在生物体内大多具有特殊的生理作用。其中L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate alpha-decarboxylase,EC:4.1.1.11,PanD/ADC)因其能够催化L-天冬氨酸脱去α-羧基生成β-丙氨酸而成为最受关注的氨基酸脱羧酶之一。β-丙氨酸作为重要的平台化合物,是合成泛酸钙、肌肽、1,4-丁二胺、丙烯酰胺等大宗化学品的前体,在生物制药、食品、化工等领域均有广泛的应用,具有巨大的工业价值。当前利用L-天冬氨酸α-脱羧酶和廉价原料L-天冬氨酸绿色制造β-丙氨酸已逐步成为取代传统化学法的主流工艺。然而,已实现工业化应用的L-天冬氨酸α-脱羧酶仅来源于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌,生产效率极为低下,因为它们在催化过程中均表现出不可逆的失活现象(简称催化失活),而目前该不可逆失活的机制尚没有被清晰解释,是相关生物产业发展的严重桎梏。本论文通过构建L-天冬氨酸α-脱羧酶的假定蛋白文库,获得了大量不同来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶资源,考察了该酶的催化失活规律。通过动力学分析,解析这一类酶催化失活的机制,并且建立了催化失活强度的表征方法;最后,从自剪切加工和催化结构域两个方面鉴定催化失活相关的结构基础。主要研究结果如下:(1)通过构建假定蛋白文库,筛选获得了53种不同来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因。通过对GenBank生物信息数据库中L-天冬氨酸α-脱羧酶编码基因的查找和系统进化分析,建立了假定蛋白文库,实现了其中38种重组酶在大肠杆菌系统中的表达与纯化,进一步的酶活力测定结果表明其中33种重组酶具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性。通过分析文库中重组酶催化失活情况,发现丙酮酰依赖型L-天冬氨酸α-脱羧酶(PYR-ADC)存在普遍的催化失活作用,然而磷酸吡哆醛依赖型L-天冬氨酸α-脱羧酶(PLP-ADC)没有表现出催化失活作用。另外,通过对酶活力的调查结果显示,目前现有的工业酶是低效的,文库挖掘获得了8个催化效率更高的酶,其中来源于Corynebacterium jeikeium的PD_(Cjei)比酶活达到11.55 U/mg,为目前报道最高。(2)通过催化失活动力学分析,发现了PYR-ADC催化失活的不可逆性,并且建立了催化失活强度的表征方法。通过对重组酶剩余酶活与反应时间/底物浓度关系的测定,发现该酶的失活作用属于基于机理的失活(Mechanism-based enzyme inactivation,MBEI)类型,催化过程中底物与活性中心结合破坏丙酮酰基团结构,造成了酶的不可逆失活。该酶在底物浓度500 mM以内其剩余酶活的自然对数与反应时间呈线性相关,利用该线性关系对应的失活速率(k_(obs))建立了催化失活强度的快速表征方法,从而比较文库中不同来源重组酶的催化稳定性强弱。(3)基于文库鉴定了L-天冬氨酸α-脱羧酶催化失活相关自剪切机制的关键氨基酸。利用Tricine-SDS-PAGE分析文库中33株PYR-ADC的电泳条带分布,按照自剪切效率的大小将其分为三类。结合分类结果和催化活性分析,说明了自剪切加工是获得催化功能结构(即PYR基团)的必要步骤;结合分类结果和系统发育分析,发现Class I和Class III的重组酶在自剪切加工位点附近的保守氨基酸具有明显差异:Class I的保守氨基酸序列为EGSCA而Class III的为VGSIT。进一步地,通过点突变验证和蛋白结构比较,发现自剪切位点附近的Val23、Ile26、Thr27和Glu56是影响自剪切加工的关键氨基酸位点。(4)基于文库鉴定了L-天冬氨酸α-脱羧酶催化失活相关功能结构域的关键氨基酸。根据文库中不同来源的重组酶的催化稳定性差异和蛋白质结构信息选择了12个突变位点,利用点饱和突变技术构建突变文库,利用基于比色的高通量筛选方法筛选催化活性提高的突变体,进一步动力学参数测定结果发现氨基酸位点Arg3、Ala74和Glu42的突变对酶催化活力的提升有帮助,其中位点Arg3和Ala74是影响催化稳定性的关键氨基酸位点。突变体中R3K较野生型在催化性能上有明显提高:催化效率提升了3倍,催化稳定性提高了66.38%。(5)针对文库发现的非催化失活型PLP-ADC进行了功能鉴定及应用分析。从数据库中查找了6个PLP-ADC编码基因序列,利用基因合成技术获得了PLP-ADC的基因,并通过分别构建含组氨酸和GST标签的表达载体,在大肠杆菌表达系统中对重组酶进行了表达与纯化。结果发现来源于古细菌的3株重组酶具有良好的活性,选择其中酶活最高的PD_(Mja)(6.87 U/mg)进行酶学性质分析,发现该酶最适温度和最适pH分别为80℃和8.0,具有很好的热稳定性。进一步进行酶催化转化的研究发现PLP在反应过程中与底物结合发生了降解,因此反应过程中辅酶PLP的稳定性和回收利用是该酶应用上的主要限制因素。
【图文】：

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图 1-1 L-天冬氨酸 α-脱羧酶自剪切加工过程示意图Fig. 1-1 Schematic representation of self-processing reaction in L-aspartate alpha-decarboxylase（2）L-天冬氨酸 α-脱羧酶的促进子（PanZ）的发现和功能研究尽管体外 E.coli 的 PanD 在 37℃条件下孵化能加速其加工过程，获得一定程度的活化，但是延长孵化时间，其活化速率相对于体内还是相差很多，这说明生物体内可能有促进原酶加工的催化剂[53]。然而，在丙酮酰依赖型脱羧酶的报道中，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的活化能被腐胺和亚精胺激活，而组氨酸脱羧酶能被酶 HdcB 激活。因此国外学者们也开始对 PanD 的促进子（PanZ）展开了研究。Nozaki 等[53]分析了泛酸缺陷型突变体的染色体突变情况，在染色体 89min 的位置发现了在泛酸代谢途径中的关键基因 yhhK（后也称 panZ, panM））。经研究发现该基因能促进 PanD 的激活，同时保守存在于大肠杆菌相关的肠道菌群中，例如 Shigella,Salmonella, Klebsiella 和 Yersinia 等。肠道菌群的泛酸含量丰富，通过 PanZ 对 PanD 的调控能有效控制 β-丙氨酸的合成，进而调控泛酸以及辅酶 A 的代谢。Stuecker 等[54]发现PanZ 是一种类似 Gcn5 的 N-乙酰转移酶蛋白，它没有乙酰转移酶活性，但是具有乙酰辅酶 A 的感应功能，能促进 PanD 的熟化。

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1-3 L-天冬氨酸 α-脱羧酶的脱羧作用及伴随的转氨作用推测机3 Postulated mechanisms for L-aspartate α-decarboxylase decarboxyladecarboxylation-dependent transamination（注：图中质子化位置用粗体 H 原子标出。）酸 α-脱羧酶分子改造研究进展的特殊加工机制和催化特性，目前对 PanD 的研究主要注释，，自剪切和催化机理的解析等理论研究水平，对其应化过程中酶的稳定性是限制其应用的主要原因，同时由氨作用，酶的重复利用率也受到限制，因此其分子改造和催化稳定性。是 PanD 获得催化活性不可或缺的加工步骤。不同微生蛋白本身的分子结构[86]，因此自加工效率是 PanD 提高文景等[87]克隆了谷氨酸棒杆菌 ST01 的 panD 基因获得影响自剪切和活性中心的氨基酸残基 Arg3、Lys9、Arg
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;TQ426.97

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