娄地青霉脂肪酶PrLip的酶学性质、晶体学及其在米糠油脱酸中的应用研究

发布时间：2024-07-07 06:16

　　偏甘油酯脂肪酶是一种对酯类底物有高度选择性的脂肪酶,能水解甘油单酯和甘油二酯底物,对甘油三酯底物无水解活力。其独特的底物识别特性使其在油脂加工及脂质改性领域具有广阔的应用前景。但目前已知的偏甘油酯脂肪酶种类甚少,对其基础理论及应用研究仍有待深入。本论文以娄地青霉(Penicillium roqueforti)来源的偏甘油酯脂肪酶Pr Lip为研究对象,研究其异源表达及纯化、酶学性质、晶体学结构及在高酸价油脂脱酸中的应用,为阐明偏甘油酯脂肪酶的催化功能提供结构基础,同时为工业应用提供科学指导。具体研究内容以及结果如下:(1)偏甘油酯脂肪酶Pr Lip的制备及酶学性质研究。构建Pr Lip毕赤酵母基因工程菌,筛选获得高效表达目标蛋白的阳性克隆菌株。30℃发酵培养60 h后利用阴离子交换层析法纯化粗酶液,获得纯度大于90%的重组Pr Lip,SDS-PAGE显示其蛋白分子量大小为31 k Da。酶学性质表征结果显示:该酶的最适反应温度为45℃,最适反应p H值为7.0,40℃条件下半衰期为6 h。Pr Lip在碱性环境中更稳定,具有良好的温度耐受性及表面活性剂耐受性。通过Pr Lip催化水解...

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号表
第一章 绪论
    1.1 偏甘油酯脂肪酶的简介
        1.1.1 偏甘油酯脂肪酶的来源
        1.1.2 偏甘油酯脂肪酶的生理功能
    1.2 偏甘油酯脂肪酶的结构特点
        1.2.1 偏甘油酯脂肪酶的结构研究进展
        1.2.2 偏甘油酯脂肪酶的底物识别机制
    1.3 偏甘油酯脂肪酶的工业应用
        1.3.1 偏甘油酯脂肪酶应用概述
        1.3.2 偏甘油酯脂肪酶在高酸价米糠油脱酸中的应用
    1.4 蛋白质晶体学
        1.4.1 蛋白质结晶原理
        1.4.2 蛋白质结晶方法
        1.4.3 蛋白质晶体衍射及数据处理
    1.5 本课题研究的意义和主要内容
        1.5.1 本课题研究的意义
        1.5.2 本课题研究的主要内容
        1.5.3 本课题研究的技术路线
第二章 脂肪酶PrLip的制备与酶学性质研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料与仪器
        2.2.1 载体和表达宿主
        2.2.2 主要材料和试剂
        2.2.3 主要仪器和设备
        2.2.4 培养基及溶液配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 脂肪酶PrLip的表达与纯化
        2.3.2 脂肪酶PrLip水解酶活力及蛋白浓度的测定
        2.3.3 p H值对脂肪酶Pr Lip酶活力的影响
        2.3.4 温度对脂肪酶PrLip酶活力的影响
        2.3.5 金属离子、有机溶剂及表面活性剂对脂肪酶PrLip酶活力的影响
        2.3.6 制备PrLip冻干粉
        2.3.7 脂肪酶PrLip的底物选择性
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 脂肪酶PrLip序列分析
        2.4.2 脂肪酶PrLip的表达与纯化
        2.4.3 p H值对脂肪酶Pr Lip酶活力的影响
        2.4.4 温度对脂肪酶PrLip酶活力的影响
        2.4.5 金属离子、有机溶剂及表面活性剂对脂肪酶PrLip酶活力的影响
        2.4.6 脂肪酶PrLip的底物选择性
        2.4.7 不同来源的偏甘油酯脂肪酶的酶学特性比较
    2.5 本章小结
第三章 脂肪酶PrLip的晶体制备及结构解析
    3.1 引言
    3.2 实验材料与仪器
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 缓冲液及优化试剂的配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 脂肪酶PrLip凝胶过滤色谱层析
        3.3.2 脂肪酶PrLip结晶蛋白浓度的筛选
        3.3.3 脂肪酶PrLip结晶条件的初筛和优化
        3.3.4 脂肪酶PrLip晶体的观察及捞取
        3.3.5 脂肪酶PrLip衍射数据的收集和处理
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 脂肪酶PrLip凝胶过滤层析纯化
        3.4.2 脂肪酶PrLip结晶条件的筛选和优化
        3.4.3 脂肪酶PrLip衍射数据处理
        3.4.4 脂肪酶PrLip的结构分析
    3.5 本章小结
第四章 脂肪酶PrLip催化高酸价米糠油脱酸的应用研究
    4.1 引言
    4.2 实验材料与仪器
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 实验仪器
        4.2.3 流动相及缓冲液配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 固定化载体的筛选
        4.3.2 优化固定化的缓冲液pH值及酶载比
        4.3.3 固定化PrLip酶活力测定方法
        4.3.4 筛选固定化PrLip催化米糠油脱酸的酰基受体
        4.3.5 固定化PrLip催化高酸价米糠油脱酸的工艺优化
        4.3.6 HPLC分析脂肪酸含量变化
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 固定化载体筛选
        4.4.2 固定化缓冲液pH值及酶载比的优化
        4.4.3 不同酰基受体对固定化PrLip脱酸效果的影响
        4.4.4 固定化PrLip催化高酸价米糠油脱酸的工艺优化
    4.5 本章小结
结论与展望
    一、主要结论
    二、论文创新点
    三、展望与设想
参考文献
攻读硕士学位期间取得的研究成果
致谢
附件



本文编号：4003281