α-L-鼠李糖苷酶生产菌株的筛选及其应用

发布时间：2020-04-05 10:11

【摘要】：黄酮类化合物以游离态或成苷的形式分布于自然界中,由于苷元及糖苷的数量、种类、连接方式的不同,使得黄酮类化合物的结构复杂多样。黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗病毒等药理活性,但是黄酮类化合物普遍水溶性差,导致其利用效率低。为了提高黄酮类化合物的水溶性,目前主要对黄酮类化合物进行结构修饰,而去糖基化是其中一种常用手段。去糖基化包括传统的化学水解和生物酶催化法,传统化学方法采用硫酸或盐酸水解黄酮类化合物,该方法反应激烈,对设备要求高,副产物多;生物酶催化法采用酶对黄酮类化合物进行酶水解,进而达到去糖基的作用。由于大部分黄酮类化合物末端带有鼠李糖,进行影响其水溶性和药理活性,而α-L-鼠李糖苷酶可以高效、专一水解黄酮类化合物的末端鼠李糖,进而增大其水溶性,提高其利用效率。因此,筛选产α-L-鼠李糖苷酶的菌株具有非常重要的意义。本研究首先从霉变的柚子及附近的土壤中采样,初筛得到20株产α-L-鼠李糖苷酶的菌株,测定各株菌株所产α-L-鼠李糖苷酶的酶活,其中No.5号菌株所产α-L-鼠李糖苷酶酶活最高,高达484.25 U/m L。观察No.5号菌株的菌落形态和显微结构初步确定该菌株是黑曲霉,再将该菌株的18S rRNA序列与NCBI数据库的进行同源比对,构建系统发育进化树,该菌株的18S rRNA序列与Aspergillus Niger 513.88具有99%的相似度。因此,可以确定该菌株为黑曲霉,并命名为黑曲霉NCU-317。以酶活为优化指标,探究黑曲霉NCU-317发酵产α-L-鼠李糖苷酶的条件,确定了培养基的最佳成分:4 g/L蔗糖,4 g/L酵母膏,0.2 g/L硫酸镁,2 g/L芦丁;最佳发酵条件:最佳发酵温度为28℃,最佳发酵初始pH值为5,最佳转速为180 r/min,250 mL摇瓶中最佳装液量为100 m L,最佳发酵周期为72 h。优化后,黑曲霉NCU-317所产α-L-鼠李糖苷酶的酶活为675.8 U/m L,是初始PDA培养基的1.4倍。采用(NH_4)_2SO_4分级沉淀和凝胶色谱层析对黑曲霉NCU-317发酵所产α-L-鼠李糖苷酶进行了分离纯化,纯化倍数分别为1.27和3.51,回收率分别为80.00%和57.86%。采用SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白分子量与迁移率的方程,测得α-L-鼠李糖苷酶的分子量为58.1 kDa。探究了α-L-鼠李糖苷酶酶学性质,其中最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5,该酶具有耐高温和耐酸性的性质,在70℃静置2 h后,其酶活为262 U/m L,约为最适温度下酶活的1/3,于pH值为2~7下静置2 h后测定酶活,其酶活几乎不受影响。Mg~(2+)和Mn~(2+)对α-L-鼠李糖苷酶具有激活作用,Fe~(2+)、Cu~(2+)和Hg~(2+)对α-L-鼠李糖苷酶起抑制作用。研究了α-L-鼠李糖苷酶的动力学,测得米氏常数K_m=14.03 mmol/(L·min),最大反应速率V_(max)=22.47 mmol/(L·min)。利用黑曲霉NCU-317所产α-L-鼠李糖苷酶催化水解芦丁,制备异槲皮素,芦丁的转化率高达95%以上,采用硅胶柱层析对异槲皮素进行分离纯化,用HPLC测定所得异槲皮素的纯度高达99.1%,通过核磁氢谱和质谱对异槲皮素的结构进行了表征鉴定。
【图文】：

黄酮类化合物母核结构

芦丁的结构
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 丁s，

本文编号：2614882