基于启动序列替换提高L-鸟氨酸产量的研究

发布时间：2020-04-05 20:08

【摘要】：L-鸟氨酸是一种非必需氨基酸,在食品和医药等领域有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌是L-鸟氨酸的常用生产菌株。N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶(argC)在谷氨酸棒杆菌中是L-鸟氨酸生物合成途径中argCJBD基因簇的第一个酶。过表达argC可增强L-鸟氨酸末端生物合成途径,从而提高L-鸟氨酸生物合成途径的流量,使L-鸟氨酸大量积累、产量提高。谷氨酸棒杆菌野生菌株的L-鸟氨酸产量为8.86±0.15 g·L-1,在替换高强度启动序列后,L-鸟氨酸产量达10.50±0.03 g·L-1,为野生型的118%,产量提升明显。本研究将谷氨酸棒杆菌S9114菌株发酵培养12 h的样品进行蛋白质组学分析,以其丰度值作为内源性启动序列的筛选依据,筛选获得16个不同强度的启动序列。将其连接增强型绿色荧光蛋白并在谷氨酸棒杆菌中进行表达。经过对荧光强度进行测定发现,荧光强度值分布在52.0 RFU/OD到5966.8 RFU/OD中,变化范围超过100倍,其中最强启动序列的启动强度为Ptac启动子的3.3倍。选择其中8个启动序列替换argC基因的启动序列并将替换菌株进行发酵培养和产量测定,结果发现随启动强度的增加L-鸟氨酸产量从0.87±0.04 g·L-1增加至10.50±0.03 g·L-1,即产量随argCJBD基因簇表达量的提高而提高。最强的PC624 05210启动序列的替换菌株的L-鸟氨酸产量是野生型的118%。本实验从谷氨酸棒杆菌S9114中筛选并验证了 16个不同强度的启动序列,为谷氨酸棒杆菌的代谢调控提供了丰富的控制元件,也为L-鸟氨酸的增产打下了坚实的基础。酶的理性设计可以使用数个碱基的突变带来酶性质的巨大改变,这种对基因组修饰极少即可控制代谢的方法在代谢工程方面有很广阔的应用前景。为了给后续的改造奠定方法基础,本研究开展了酶的理性设计工作。通过计算机辅助的模拟筛选和人工筛选,得到两个酶活分别提高2.5和2.1倍的突变体。通过结构分析发现,突变削弱了催化位点上方盖状结构的密封能力,使催化中心露出从而导致催化效率变高。该实验为酶的改造提供了新的设计策略。
【图文】：

华东理工大学硕士学位论文逦第３页逡逑方程式如图１．１所示。逡逑ＮＨ逦０逦Ｏ逡逑＋邋…。二邋Ｈ２Ｎ－＾＾０Ｈ邋＇Ａ．逡逑ｎｈ２逦ｎｈ２逡逑／．－ａｒｇｉｎｉｎｅ逦Ｌ－ｏｍｉｔｈｉｎｅ逦Ｕｒｅａ逡逑图１．１酶水解ｌ－精氨酸逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｚ－ａｒｇｉｎｉｎｅ逡逑酶水解法生产ｉ－鸟氨酸具有催化速度快、产物专一性强、副产物少、转化效率高逡逑的优点，得到的产物后续的分离、纯化步骤简单，目前应用较多。张鹏等人筛选获得逡逑一株粪肠球菌，其具有较高的Ｌ－精氨酸酶活性，应用到酶水解法中可以得到１１２邋ｇｉ－１逡逑的鸟氨酸产量ｎ３］。但目前ｉ：－精氨酸酶的提取工艺复杂，且Ｉ－精氨酸的价格相对高昂，逡逑这些因素都使得生产成本处于较高的水平，生产方法价格优势不明显。逡逑１．１．４．４微生物发酵法生产Ｌ－鸟氨酸逡逑目前常用的鸟氨酸生产方法为微生物发酵法。此法相比化学合成法具有生产过逡逑程安全、产物单一、对自然友好的特点。相比酶水解法具有原料成本低廉、生产材料逡逑方便可得的特点。除此之外，发酵法还具有设备要求低、反应条件温和、分离纯化简逡逑单的优点，这些优势都明显降低了生产成本，利于大规模生产。至今，许多微生物都逡逑被发现可以积累鸟氨酸，例如，谷氨酸棒杆菌、石蜡节杆菌、大肠杆菌等，其中谷逡逑氨酸棒杆菌的研究较多

物有铜绿假单胞菌、硫化裂片菌以及大肠杆菌等。逡逑大肠杆菌中由谷氨酸合成Ｌ鸟氨酸包含五步线性反应，，编码这些酶的基因包括逡逑ｆｌｒｇＪ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ和详细途径见图１．３。在此途径中Ｚ－鸟氨酸的代谢受逡逑到两方面的调节，途径的最终产物精氨酸可以激活调控蛋白ｗｇ／？，阻止谷氨酸支路逡逑基因的表达；同时Ｌ－精氨酸可以抑制＃ｇ儿使支路流量降低。逡逑［邋Ｇｌｕｔａｍａｔｅ逡逑Ｘ邋ｐｒｏＢ＾邋一＾＼逡逑／邋Ｇｌｕｔａｍｙｌ邋ｐｈｏｓｐｈａｔｅ逦Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｇｌｕｔａｍａｔｅ逦＼逡逑／邋丨逦ｉ邋ａｒ？Ｂ邋＼逡逑／邋Ｇｌｕｔａｍａｔｅ邋ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ逦Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｇｌｕｔａｍｙｌ－Ｐ逦＼逡逑／逦Ｉ逦ｉ邋ａｒｇＣ逦＼逡逑ｙ逦Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｇｌｕｔａｍａｔｅ逦＼逡逑Ｐｙｒｏｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ逦ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ逡逑ｐｒ0Ｃ邋｜逦ｊ邋ａｒｇＤ逦Ｉ逡逑ＶＰｒｏｌｉｎｅ逦Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ逦／逡逑ｉ邋ａｒｇＥ逦／逡逑￡－Ｏｎｉｉ邋ｔｉｌｉｎｇ邋：■＞］逡逑ｉ邋ａｒｇＦＩ邋ｙ逡逑Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ逡逑ｉ邋ａｒｇＧＨＸ逡逑Ａｒｇｉｎｉｎｅ＾＾逡逑图１．３大肠杆菌中Ｌ－鸟氨酸的代谢途径逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ邋ｉｎ邋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ．逡逑谷氨酸棒杆菌中ｉ－谷氨酸合成ａ－鸟氨酸需要经过四种酶的催化。其中％乙酰谷氨逡逑酸的生成是由具有双功能的ａｒｇｊ编码的酶完成的，是典型的循环途径ＷＩ。具体代谢途逡逑径参见图１．４。在此代谢途径中
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ922

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本文编号：2615475