以葡萄糖为碳源的毕赤酵母发酵工艺优化及诱导调控

发布时间：2020-04-10 02:58

【摘要】：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前最为成功的真核表达系统之一,与其它表达系统相比在产量、表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰等方面有明显的优势。工业生产中可将毕赤酵母发酵过分为菌体生长和甲醇诱导两个阶段。一般的,在菌体主要使用甘油作为碳源,在诱导阶段主要依靠溶氧数值,结合生产经验来进行诱导调控。针对甘油成本高、粘度大等缺陷,本论文首先考察了采用葡萄糖替代甘油作为碳源进行菌体扩增的可行性,然后引入生物传感器进行甲醇浓度检测,在溶氧电极基础上,建立了更为精准的诱导调控策略。主要取得了如下研究成果:一.考察了葡萄糖代替甘油进行毕赤酵母发酵的可行性,摇瓶和10L发酵罐结果表明,以甘油和葡萄糖作为碳源进行毕赤酵母发酵时,菌体的生长过程是同步的,因此,葡萄糖代替甘油进行毕赤酵母发酵是可行的。(1)摇瓶发酵结果表明,只要可以将初始碳源的残留处理完全,目标蛋白的表达与生长阶段的碳源种类关系不大,葡萄糖和甘油均可。(2)10L发酵罐发酵结果表明,通过优化葡萄糖的补料策略,可以达到与甘油为碳源进行发酵时的菌体细胞生长速率,在降低原料成本的同时,没有延长发酵周期。(3)以毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶和脂肪酶为例,采用葡萄糖为唯一碳源进行菌体细胞扩增时,经过约48 h的培养,菌体细胞湿重均可达到180~220 g/L。二.发酵过程调控方面,采用生物传感器进行葡萄糖和甲醇的快速检测,降低了葡萄糖的阻遏效应,避免了因甲醇用量不当导致的细胞中毒情况,建立了更为精准的调控策略。(1)采用生物传感仪密切监控葡萄糖和甲醇的浓度,实现了菌体生长和诱导阶段的精准调控,避免了由于溶氧电极标定和使用误差导致的负面影响。(2)优化了甲醇诱导策略,通过针对性的缩短“饥饿时间”或者直接诱导,或者提前添加甲醇等方式,实现了外源蛋白的高效表达。(3)以毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶和脂肪酶为例,发酵周期为82-90h,活性分别为:葡萄糖氧化酶27.3 U/L、32.9 U/L,脂肪酶5300 U/L、5175 U/L,使用葡萄糖作为碳源发酵以达到与使用甘油基本一致的水平。
【图文】：

毕赤酵母,发酵过程,甘油

碳源进行培养，通常在培养约 16-24h后毕赤酵母耗尽发酵基础培4%的甘油，期间通过对通气和搅拌转速的调节维持溶氧水平在 30%增加[35]。批流加的过渡阶段。在甘油流加阶段（Glycerol fed-batchphase）加基础碳源即甘油，来使得菌体细胞继续扩增。在菌体扩增阶段甘油其耗尽时溶氧值会骤升至 100%左右，这时开始补充流加 50%控制甘油流加速率、通气量和搅拌转速，维持溶氧水平在 30%左导阶段。在甲醇流加诱导阶段（Methanol fed-batchphase）停止流基中的甘油完全消耗后，即溶氧数值升至 100%时，开始甲醇的流1 启动子表达驱动外源基因表达。此阶段中，调整甲醇补加速率， 20%左右，使菌体慢慢适应利用甲醇进行生长并表达目标外源蛋白的蛋白和菌株的不同，此阶段控制最终甲醇流加的速率和流加持续不同[37]。

毕氏酵母,代谢途径,甘油,丙酮酸

4图 1.2 毕氏酵母甘油代谢途径[39]Fig. 1.2 Metabolic pathway of glycerol in Pichia pastoris甘油在细胞内，首先被甘油激酶磷酸化为三磷酸甘油 G3P（Glycerolosphate）。G3P 在三磷酸甘油脱氢酶的作用下被氧化为磷酸二羟丙酮。经解过程，磷酸二羟丙酮被分解成丙酮酸（PYR）[40]。丙酮酸在丙酮酸脱氢用下被氧化为乙酰辅 A（Acetyl-CoA）。乙酰辅酶 A 直接进入三羧酸循环Acycle），在此过程中会有大量细胞物质合成，同时伴随电子载体（NADH量的转换。在代谢过程中，如果溶氧或者丙酮酸脱羧反应速率受到限制，会进入乙醇发酵途径[41]。此时，，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成乙醛在醇脱氢酶的作用下生成乙醇。而当上述限制解除后，乙醇又可作为基质，这时，乙醇首先被氧化为乙醛，乙醛进而被氧化为乙酸盐，最后转化为
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.6

【参考文献】