木质素降解酶高产菌株的筛选及酶学性质研究

发布时间：2020-04-11 15:49

【摘要】：我国农作物秸秆资源丰富,但由于秸秆中木质素的存在,其利用和降解都比较困难,而微生物能够依靠木质素降解酶完全降解秸秆中的木质素。本论文旨在筛选出高产木质素降解酶菌株,并对菌株产酶及降解秸秆特性,固态发酵条件,漆酶纯化及酶学性质进行系统研究与分析,结果如下:1.分离纯化获得39株真菌菌株,经初筛和复筛筛选出两株产漆酶和锰过氧化物酶能力较强的菌株:EM03(滑菇Pholiota nameko)和EM07(杏鲍菇Pleurotus eryngii),作为试验菌株进行下一步试验。2.对菌株EM03和EM07进行固态发酵,试验结果表明两株菌产漆酶和锰过氧化物酶具有周期性,培养12 d后酶活性达到峰值,其中菌株EM03发酵基质中漆酶和锰过氧化物酶酶活性最大值分别为37.58 Ug~(-1)substrate和20.78 Ug~(-1)substrate;菌株EM07发酵基质中漆酶和锰过氧化物酶酶活性最大值分别为36.16 Ug~(-1)substrate,8.97 Ug~(-1)substrate。固态发酵60 d后,EM03固态基质失重率达到49.43%,半纤维素降解率达到57.75%,纤维素的降解率达到46.03%,木质素降解率达到74.45%;EM07固态基质失重率达到17.35%,半纤维素降解率达到12.95%,纤维素的降解率达到9.70%,木质素降解率达到51.69%。结合产酶和降解实验结果发现,EM03具有更高的产酶能力和降解木质纤维素的能力,作为试验菌株进行下一步试验。3.通过部分因子试验、中心组合试验和响应面分析对影响菌株EM03固态发酵效果的因素进行筛选、分析和优化。部分因子试验结果表明发酵营养液中CuSO_4浓度,固态基质初始含水量,发酵温度这三个因素是影响固态发酵效果的关键因素。通过中心组合试验和响应面分析得到菌株固态发酵产酶和降解木质纤维素的最优发酵条件,优化结果可以为固态发酵中关键因素参数的设定提供理论依据,从而提高产酶量和降解率,缩短发酵时间,降低发酵成本。4.利用硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析从EM03(pholiota nameko)固态发酵浸提液中纯化出一种漆酶,命名为Lac-B。SDS-PAGE显示单一条带,为分子量约为50.2 kDa。根据Lac-B光谱学特征分析该酶具有III型双核铜中心,结合N末端氨基酸序列对比结果和光谱学特征,推测该酶可能是一种黄色漆酶。Lac-B在70℃时表现出最强活性,热稳定性高,在50℃以下的温度中保温90 min后依然保持初始活性的100%以上。在酸性环境(pH 3.0-5.0)下对底物的反应活性高,稳定性强。对重金属有一定的耐受性,低浓度的K~+可以作为提高漆酶活性的弱激活剂。NaN_3和DTT对酶活性有强烈的抑制作用,螯合剂EDTA的存在下,Lac-B活性会被轻微抑制。以ABTS为底物,Lac-B的K_m值为0.32μM,V_(max)值为0.53 mM/min,以DMP为底物K_m值为0.43μM,V_(max)值为0.48 mM/min。此外,纯化酶能够在不存在氧化还原介体的情况下降解三苯甲烷类、杂环类和双偶氮类染料。结果表明Lac-B在处理酸性废液和染料脱色中具有较好的理论研究价值和应用前景。
【图文】：

显色,氯化锰,苯胺蓝,愈创木酚

初步编号为：S1-S6；（2）食用菌：通过分离纯化获得 8 种食用菌纯培养菌丝体，初步编号为：EM01（茶树菇 Agrocybe aegirit），EM02（双孢菇 Agaricus bisporus），EM03（滑菇 pholiota nameko），EM04（海鲜菇 Hypsizygus marmoreus），EM05（平菇 Pleurotus ostreatus），EM06（香菇 Lentinus edodes），EM07（杏鲍菇 Pleurotus eryngii Quel.），EM08（杨树菇Agrocybe aegerita(Brig.ex Fr.) Sing）；（3）野生担子菌：通过分离纯化获得 17 株野生担子菌纯培养菌丝体，初步编号：WB01-WB17；（4）实验室菌株：对实验室保藏的 8 株担子菌菌株进行活化，，初步编号：LF01-LF08。2.2.2 菌株的初筛培养一段时间后，愈创木酚平板显色反应、苯胺蓝平板褪色反应和氯化锰平板显色反应结果如图 2.1 所示，以显色圈和褪色圈出现需要时间的长短以及显色圈和褪色圈直径的大小和颜色深浅作为依据进行的筛选。a b c

电泳图,子实体,菌株,形态特征

图 2.2 菌株 WB04 形态特征图（a，子实体；b，菌落；c，菌丝 40×10）Fig.2.2 Morphological characteristics of strain WB04（a, sporocarp; b, colony; c, hypha 40×10）2.2.4.2 分子生物学鉴定图 2.3 为菌株 WB04 ITS 区 PCR 扩增产物电泳结果，单一条带，与 Marker 电泳条带对比，单一条带位于 750 bp 左右，与目标条带大小一致，表明菌株 ITS 区扩增正确，可以用于测序。图 2.3 菌株 WB04 ITS 区 PCR 扩增产物电泳图
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q936;TQ925

【参考文献】