海藻糖合酶分子改造及在毕赤酵母中的分泌表达研究

发布时间：2020-04-18 20:28

【摘要】：海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α-1,1糖苷键连接而成二糖,有非还原性末端,并且有较强的生物活性,在食品医药领域得到广泛应用。海藻糖合酶只需一步反应就能将麦芽糖转化为海藻糖,反应在低温下即可进行,成本较低。本研究通过改造来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida P06)的海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS),提升反应转化率,并在毕赤酵母中进行分泌表达,具体研究成果如下:(1)利用I-TASSER在线服务器进行TreS的三维结构预测,利用AUTODOCK进行底物与酶的对接,通过分析酶-底物复合体,选择了距离底物结合区域4~8?范围的氨基酸。将TreS利用NCBI进行Blast分析,构建一个500种海藻糖合酶的序列比对库。分析4~8?范围氨基酸残基的保守性,排除高度保守序列,最终选择了位于催化口袋上方的232位天冬氨酸、底物进出通道的407位缬氨酸以及位于口袋底部的490位赖氨酸。设计饱和突变引物,以质粒pET-15b-tres为模板,构建突变体库,经过筛选验证获得三株转化率提高的突变酶(V407M、K490L、V407M/K490L),其转化率分别提高了7.2%、9%及11.9%。酶学性质分析表明,V407M/K490L的热稳定性及耐酸性都得到增强,反应动力学参数证明,突变对其底物结合能力和催化效率都起到积极影响。(2)将得到的突变酶(tres3)利用分子生物学手段,连接至毕赤酵母表达载体pGAP-ZαA,构建重组表达载体pGAP-ZαA-tres3,利用电转化整合到毕赤酵母GS115中。通过阳性验证及高拷贝筛选,得到重组毕赤酵母GS115/pGAP-ZαA-tres3,摇瓶发酵结果表明,重组菌胞内酶活力最高为120U/g。(3)对构建的重组毕赤酵母GS115/pGAP-ZαA-tres3进行发酵培养基及发酵条件的优化,摇瓶条件下以优化的培养基及发酵条件,重组菌胞内酶活力提升了35%。以优化后的培养基进行重组酵母的高密度发酵,通过流加葡萄糖的方式控制菌体生长代谢速率,发酵结果显示胞内最高酶活力为695U/g,胞外酶活力最高为29.3U/mL。
【图文】：

海藻糖,结构式

第 1 章绪论与性质se）最早是 1832 年由Wiggers在黑麦的麦角无脊椎动物细胞中发现海藻糖[1,2]。随着研究海藻糖，例如植物中的拟南芥和卷柏，微生类中都有存在[3,4,5]。在大肠杆菌（Escheric分歧杆菌（Mycobacteria）、脂肪杆菌（Pim海藻糖的存在，证明了海藻糖是自然环境中学结构由Bredereck通过核磁共振技术发现苷键连接而构成的具有非还原性末端构式为：

原理图,原理,引物,质粒

图 2.1 全质粒 PCR 饱和突变原理Fig2.1 The schematic of the mutagenesis of Full- plasmid PCR实验所用引物利用 Oligo7.0 软件设计，引物由上海生工生物负责合成。引物序列如表 2.5 所示：其中下划线代表饱和突变位点。表 2.5 饱和突变引物Table2.5 Saturation Mutation PrimersPrimer name Primer sequence（5'-3'）ASP232-FASP232-RVAL407-FVAL407-RGGCGTGAAGGAAACCNNKTGGAGCGCCACGCCGCGGCGTGGCGCTCCAMNNGGTTTCCTTCACGCCAACCATGACGAGCTGACCNNKGAGCTGGTGCACTTCTGGCCAGAAGTGCACCAGCTCMNNGGTCAGCTCGTCATGGTTLYS490-F AGCGGATATCGAACTGATCNNKAAGGTGCACCTGCTGCTGGLYS490-R CCAGCAGCAGGTGCACCTTMNNGATCAGTTCGATATCCGCT以提取自 E.coli DH5α的 pET-15b-tres 质粒为模板，，以表 2.5 中的引物为扩增引物，利用 2×Phanta Max Master Mix 高保真聚合酶进行突变质粒扩增，其中
【学位授予单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q55;TQ920.6

【参考文献】