通过提高苏氨酸脱氨酶热稳定性提高L-2-氨基丁酸的产量及辅酶利用率

发布时间：2020-04-18 21:55

【摘要】：L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非天然手性氨基酸,在医药、化工领域都有广泛的应用。L-ABA的合成方法主要有化学法和生物法,其中以亮氨酸脱氢酶合成L-ABA的体系具有转化效率高、无副产物以及产物易分离等优点,在工业化生产上具有很大应用前景。亮氨酸脱氢酶合成L-ABA的体系是以L-苏氨酸为底物,先经苏氨酸脱氨酶脱氨生成α-酮丁酸,再利用亮氨酸脱氢酶将酮酸还原为L-ABA,同时还原反应所消耗的NADH通过甲酸脱氢酶再生。但是,在该生产体系中存在辅酶消耗量过大的问题,即反应过程中需再添加辅酶。针对此现状,本文通过在嗜温表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)中表达热稳定蛋白,再对重组细胞热处理以消除宿主蛋白对L-A B A合成的影响。使体系中辅酶的损耗降低,从而降低辅酶的需求量,为大规模工业生产L-ABA提供了更大的可能。同时,也为有辅酶参与的工业生物催化路径提供了一定参考。本文首先在嗜温通用表达宿主E.coliBL21(DE3)中分别表达Escherichiacoli K12来源的苏氨酸脱氨酶(L-TD),热稳定的Bacillus sphaericus DSM730来源的亮氨酸脱氢酶(L-LeuDH)及Candida boidinii来源的甲酸脱氢酶(FDH)。针对野生型L-TD的热稳定性差而无法满足热处理的问题,故对其进行稳定性改造。首先设计了针对L-TD的高通量筛选方法,并利用易错PCR构建具有稳定突变率的突变体库。通过筛选,得到了三株阳性突变株:A14T、T344A和R449C,其在42℃下的半衰期(t1/2,42℃)从野生型的10min分别延长到14min,19 min和15 min。T5015(酶在该温度下15 min内丧失50%的活力)则由39。C分别提高到41 ℃,42 ℃和41.2 ℃。为获得更多的阳性突变株,利用多重序列比对结合计算机模拟的方法选出可能与L-TD的稳定性相关的氨基酸残基,再通过定点饱和突变进行验证。最终筛选到两株阳性突变株G323D和F510L,其t1/2,42℃分别从野生型的10min延长到57min和44min,T TV5则分别提高到46.2℃和44.8℃。以稳定性提高最明显的突变株G323D为模板,分别与A14T,T344A,R449C及F510L进行组合突变。其中组合突变株G323D/F510L的稳定性提高最明显,共t1/2,42℃延长至201min,T5T15提高到52.5℃。再以G323D/F510L为模板,分别与T344A,R449C,T344A/R449C进行组合突变,其中组合突变株G323D/F510L/T344A的热稳定性最优,其t1/2,42℃和T5015分别为210min和53℃。探究了 L-ABA催化体系中FDH酶活和辅酶添加量对L-ABA合成的影响,发现体系中FDH与辅酶的添加量对L-ABA产率影响都很大。通过测定在50 ℃下不同热处理时长的宿主E.coli BL21(DE3)蛋白对NADH的影响,发现50℃热处理1h能有效的解除宿主蛋白对NADH的降解,即此时宿主蛋白对体系中NADH的浓度影响很小。最后,对比改进后体系(经热处理的G323D/F510L/T344A、L-LeuDH、FDH)与原始体系(野生型 L-TD、L-LeuDH、FDH),改进后体系在较低的NAD+添加量(0.04 g/L)时,L-ABA的摩尔转化率可达到99%,而原始体系的摩尔转化率只有65.3%。
【图文】：

旋光异构体,氨基丁酸,非蛋白质氨基酸

士学位论文逦逡逑第一章绪论逡逑基丁酸是一种非蛋白质氨基酸，少量存在于动、植物的组织器官中。有一个手性碳原子，故有两种旋光异构体，即Ｌ（＋）－２－氨基丁酸和Ｄ（＋酸（图邋１．１邋）。其中邋Ｌ（＋）－２－氨基丁酸（Ｌ－２－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ邋ａｃｉｄ，邋Ｌ－ＡＢＡ），４Ｈ９ＮＯ２，分子量为邋１０３．１１９８，ＣＡＳ邋号：１４９２－２４－６，熔点：２９８－３０４邋°ＣｍＨｇ压力下沸点为２１５＿２°Ｃ，，闪点８３．９°Ｃ，相对密度为１．１０５，水溶（２２。（：），比旋光度［？］＾）为２丨．６。，；２５。＜：的蒸汽压为邋０．０５７９１１１１１１１＾。逡逑ＯＨＯＨ逡逑

生物发酵法,丁酸,苏氨酸

士学位论文用Ｄ－氛基酸氧化酶选择性氧化Ｄ－２－氨基丁酸，将外消旋Ｄ拆分从而获得Ｌ－ＡＢＡ，收率可达到８５邋％邋［１＼逡逑合成法逡逑酵法逡逑Ｌ－苏氨酸重组￡．邋ｃｏ／／为出发菌株，通过重组表达／／以和ＢＡ工程菌，并通过分批补料发酵最终Ｌ－ＡＢＡ可以积累１９ｇ／Ｌ，１１．６３邋％，合成途径如图ｌｊ１１』。通过在ｃｅ７，ｅｖ／ｓＤ及谷氨酸脱氢酶，以Ｌ－苏氨酸为底物发酵生产（Ｓ）－２－氨基丁邋ｍｇ／Ｌ丨１２丨。逡逑Ｇｌｕｃｏｓｅ逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ921

【参考文献】