高产纤维素酶菌株的筛选及其突变型分析和产酶优化

发布时间：2020-04-19 22:52

【摘要】：纤维素酶在食品,医药,纺织酿造等工业具有广阔的应用前景,蕴藏着巨大的市场潜力。随着对纤维素酶需求量的日益增大,纤维素酶生产周期长、活力低、生产成本高等问题履待解决。分子生物学技术的飞速发展使得许多基因工程操作工具已经成功应用于真菌系统,里氏木霉的基因工程改造效率得到了极大地提高。然而纤维酶是一个及其复杂的酶复合体系,纤维素酶活的提高与一系列基因的表达调控息息相关。利用基因工程改造对菌株进行改造已经取得了一定的成果,但仍需进一步研究来提高纤维素酶的产量。因此,开展纤维素酶高产菌株的选育工作仍然是必要的。本课题以里氏木霉RUT-C30为出发菌株,利用常压室温等离子体诱变系统对其进行诱变,筛选性状优良的高产纤维素酶突变菌株。对高产菌株进行全基因组测序,解析其突变型。并对高产菌株的发酵工艺进行优化,为纤维素酶的工业化生产提供参考。主要内容包括:1.利用常压室温等离子体诱变系统以及刚果红溶胀培养基构建基本筛选方法,并对筛选培养基进行优化。确定了初筛培养基中添加乳糖0.3%(w/w)时可以明显缩短孢子萌发时间,添加氯化锂0.1%(w/w)可以显著增加正突变率。利用常压室温等离子体诱变系统对里氏木霉RUT-C30进行诱变,最终筛选得到一株滤纸酶活较高的菌株JNDY-13,其最高滤纸酶活可达2.21 IU·m L~(-1)是出发菌株RUT-C30的2.21倍。2.对纤维素酶高产菌株JNDY-13进行全基因组测序,并对其突变型进行分析。结果显示,在JNDY-13中鉴定出752个突变,其中18个为水解酶,34个为合成酶,20个为激酶,52个与能量代谢有关,73个与物质运输有关,38个与转录和翻译有关,8个与生长有关,399个是假设蛋白,还有110个与其他功能相关。另外,752个SNP中的105个被确认为点突变,336个为删除突变,165个插入突变和99个混合突变。3.对半乳糖激酶的基因突变分析发现,半乳糖激酶基因的454 bp处插入了18个碱基(非CDS区),经过酶活测定以及RT-PCR分析发现,相同的发酵条件下半乳糖激酶的酶活较出发菌株RUT-C30有所下降,但半乳糖激酶基因的转录量较RUT-C30显著提高。半乳糖激酶基因的转录量和纤维素酶的产量相关,故半乳糖激酶的基因突变可能与纤维素酶的产量增加相关。另外使用RT-PCR方法对JNDY-13菌株中的纤维素酶基因,半纤维素酶基因以及和纤维素酶相关的调节因子的基因的转录水平进行了分析。结果发现与出发菌株相比,在对数期前期,11个纤维素酶和半纤维素酶相关基因中,有6个基因的转录量与原始菌株相比上调。在对数中期阶段,11个纤维素酶和半纤维素酶相关基因中,有8个基因的转录量上调。然而在稳定期,纤维素酶相关基因的转录与里氏木霉RUT-C30相比显著下调。4.根据JNDY-13的特性,设计正交实验对产酶培养基各组分含量进行了优化,得到的最佳产酶培养基组成为:乳糖10 g·L~(-1),微晶纤维素10 g·L~(-1),玉米浆粉12 g·L~(-1),(NH_4)_2SO_4 1.5 g·L~(-1),MgSO_4 1.2 g·L~(-1),CaCl_2 1.4 g·L~(-1),1 mL·L~(-1) Mandels微量元素营养盐,2m L·L~(-1)吐温80,pH 4.8。用此产酶培养基发酵滤纸酶活最高可达2.64 IU·mL~(-1)。同时,设计正交实验对JNDY-13上罐发酵的条件进行了优化。得到的最优上罐发酵条件为:发酵温度28℃,搅拌转速400 r·min~(-1),通气量2 vvm,pH 5.0。在最优发酵条件下,用高产菌株JNDY-13进行分批发酵最高滤纸酶活(FPU)可达4.74 IU·mL~(-1),最高菌体含量可达8.91 g·L~(-1)。5.进行流加发酵时,以最高滤纸酶活为标准对流加的浓缩液成分进行了优化。得到的最优流加浓缩液成分为乳糖和硫酸铵(碳氮比10:1)且在最优发酵条件下进行流加发酵时滤纸酶活最高可达5.40 IU·mL~(-1),菌浓最高可达9.19 g·L~(-1)。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925

【参考文献】