活性氧响应性高分子材料和多功能可注射水凝胶用于脊髓损伤治疗

发布时间：2020-04-21 03:43

【摘要】：脊髓损伤(SCI)可引起患者严重的神经功能障碍或永久性残疾。治疗脊髓损伤的研究大致可分为两个主要领域:神经保护和神经再生。神经保护疗法侧重于阻止继发性损伤的进一步发展,而神经再生疗法则侧重于通过修复断裂的脊髓神经回路来恢复受损或失去的功能。大量的研究报告显示活性氧(ROS)在脊髓损伤后过量产生,并在继发性损伤的级联反应中发挥关键性作用,清除ROS可以防止或减轻SCI后的继发性损伤。为此,本论文首先设计合成了一系列ROS响应性的高分子材料,并研究其氧化响应性性质及用作活性氧响应性药物载体的潜力。将其中一种活性氧响应性的材料制备成脂质聚合物纳米粒子探索其脊髓损伤后清除ROS的神经保护治疗效果。同时,针对脊髓损伤修复过程中存在的多重再生障碍,设计、制备了一种同时担载神经干细胞、西妥昔单抗和FTY720药物的多功能可注射水凝胶,系统研究了其在脊髓损伤后的神经再生作用。具体研究内容和主要结论如下:(1)设计合成了一种用苯硼酸频哪醇酯连接的ROS响应性PEG化脂质材料mPEG2k-PBPE-DSA。首先通过Passerini反应合成了含有苯硼酸频哪醇酯的末端带有炔基的聚乙二醇单甲醚衍生物mPEG2k-PBPE-alkynyl,然后与叠氮化双硬脂酸甘油酯(N3-DSA)通过Cu(Ⅰ)催化的点击反应,制备成具有H2O2响应性的mPEG2k-PBPE-DSA。在含有 H2O2 的水溶液中,mPEG2k-PBPE-alkynyl 可以被H2O2氧化,并且氧化程度随H2O2的浓度增加而加快。基于原位1HNMR和质谱分析,证明了 mPEG2k-PBPE-DSA的氧化断裂机理。另外,mPEG2k-PBPE-DSA可以在水溶液中自组装成稳定的纳米胶束。该胶束可以被MCF-7细胞内吞,对巨噬细胞RAW264.7有很好的生物相容性。DLS结果显示H2O2条件下mPEG2k-PBPE-DSA纳米粒子的粒径逐渐减小,证明该纳米胶束可以在H2O2存在时被氧化最终解体。此外,体外药物释放实验表明担载尼罗红模型药物的纳米粒子能够实现药物的氧化响应性控制释放。上述实验表明,mPEG2k-PBPE-DSA有望用作活性氧响应性纳米药物载体。(2)将1,4二噻烷结构引入聚氨基酸侧链,合成了一种新型ROS响应性聚氨基酸材料。首先,通过缩合反应制备1,4-二噻烷修饰的L-谷氨酸酯(DTG),并合成相应的α-氨基-N-羧基内酸酐单体(DTGNCA);再利用端氨基聚乙二醇单甲醚mPEG5k-NH2引发开环聚合,合成具有1,4-二噻烷侧链的聚谷氨酸嵌段共聚物mPEG-b-PDTG。该两亲性聚合物在水环境中自组装成球状纳米粒子。用DLS,红外和浊度实验研究纳米粒子的H202响应行为。结果显示,在H202水溶液中,1,4-二噻烷的硫醚结构被氧化成亚砜,从而使聚合物由两亲性变成亲水性,导致纳米粒子解体。纳米粒子的氧化速率随H202浓度的增加而加快,而无H2O2存在时,纳米粒子保持稳定。同时,体外药物释放实验表明担载尼罗红模型药物的纳米粒子能够实现药物的氧化响应性控释。上述实验表明,含1,4二噻烷侧基的聚氨基酸材料有望用作ROS响应性纳米药物载体。(3)开发了活性氧响应性脂质聚合物纳米粒子作为活性氧清除剂,以减轻急性脊髓损伤后的继发性损伤。采用简单的硫醇-炔点击聚合法制备了一种高密度硫醚基聚合物,即聚丙二醇(甲硫基)乙酸酯-乙二醇二(β-巯基丙酸酯)[poly(PMT-co-EGDM)],并用卵磷脂(lethicin)和 PEG-DSPE 的混合物进一步包封,形成活性氧响应性脂质聚合物纳米粒子,称为PELPNPs。体外实验表明该PELPNPs能清除过量产生的ROS,减轻炎症反应,保护胶质细胞和神经元免受H2O2诱导的氧化损伤。动物实验结果表明,PELPNPs通过对神经元和髓鞘的有效保护,减少了损伤面积,明显改善了 SCI大鼠的运动功能的恢复。此外,我们还对PELPNPs的作用机理进行了验证研究,而且其在体内外均表现出良好的生物相容性和生物安全性。因此,我们提出的具有ROS清除功能的脂质聚合物纳米粒子在SCI的抗氧化治疗方面具有较大的潜力。(4)用氧化葡聚糖(o-Dex)和末端肼解的四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-NHNH2),通过醛基和肼形成腙键作为交联点,制备出可注射的共价适应性水凝胶Gel4P-hy-D。该水凝胶快速成胶,模量和脊髓组织相似,且有一定的膨胀性和粘附性,适用于受损脊髓处的填充。我们用Gel4P-hy-D水凝胶搭载神经干细胞(NSCs),同时加入促进NSCs向神经元分化的西妥昔单抗和抑制胶质瘢痕的药物FTY720,制备成具有多功能的可注射水凝胶(G-N-C-F)。体外和体内实验研究结果表明,西妥昔单抗和FTY720对神经再生具有协同作用。将G-N-C-F注射到急性脊髓横断损伤大鼠的损伤部位,验证其对脊髓再生和功能恢复的治疗作用。实验结果证明,植入G-N-C-F的大鼠可以增加脊髓损伤中心的神经元数量,减少胶质瘢痕的产生,促进轴突再生,从而更好的重建受损神经网络,最终有助于脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。对比实验说明多功能的可注射水凝胶的组织修复效果优于单一功能的水凝胶。该多功能的可注射水凝胶为SCI的神经再生治疗提供了新的思路,有望用于SCI的临床研究。
【图文】：

脊髓,轴突,运动信息,白质

第一章绪论逡逑１．１脊髓逡逑脊髓分为灰质（包含神经元细胞体）和白质（包含有髓鞘的轴突）（图１．１ａ）。逡逑白质可以进一步细分为几个上升或下降的束，这些束由轴突束组成，轴突束起源逡逑于大脑和周围的特定区域并投射到这些区域、这些束传输特定的信息，包括感逡逑觉信息（如温度或瘙痒）或运动信息。脊髓神经根进入脊髓并将感觉信息传递到逡逑脊髓（通过感觉根或背根）或将运动信息传递到周围（通过运动根或腹根）。脊逡逑柱将脊髓包裹在保护性的骨骼和韧带中，人类将其分为７节颈椎、１２节胸椎、５逡逑节腰椎和５节骶骨。血液由位于脊髓前方、后方和分支处的动脉供应给脊髓，以逡逑灌注脊髓实质。脊髓也被包含在厚膜内的脑脊液保护层所包围（图１．１ｂ）。脊髓逡逑（图１．１ｃ）的每个节段区域都支配着皮肤（图ｌ．ｌｄ）、肌肉（图ｌ．ｌｅ）或器官群逡逑的特定区域。脊髓损伤可导致损伤部位以下的部分或全部功能丧失。逡逑ａ逦Ｖｅｎｔｒａｌ邋ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ邋ｔｒａｃｔ逦ｃ逦１、二：’￥＇■＜■、、、逦＾邋Ｔ逡逑Ｄｏｒｓａｌ邋ｃｏｌｕｍｎ邋Ｔｅｃｔｏｓｐｉｎａｌ邋ｔｒａｃｔ逦Ｊ逡逑ｖ—感公}／人＇邋；逡逑Ｌａｔｅｒａｌ逦Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｉｎａｌ邋ｔｒａｃｔ逦Ｐ＾ＣＡ邋＞．邋Ｔ２邋＾Ｃ４逡逑ｉｐｈｗｔｂｄｌａｍｉｃ逦，逦、了卜＼逡逑ｃｏ＇ｒｔＴｃｏｓｐｉ＾ｌ逦Ｂｒａｉｎｓｔｅｍ逡逑象ｒ栜逡逑ｂ邋＼＾ｖ邋／——邋考，，亦逡逑■：二邋＿逡逑ｒ邋八逦赢邋＼逦’晶、逦ＣＳ逦Ｂｂｏｗ邋ｆｌｅｘｏｒｓ逡逑；＾＼逦Ｃ６逦Ｗｒｉｓｔ邋ｅｘｔｅｎｓｏｒｓ逡逑／NB逦：＇翁；．逦~k榦逦邋Ｃａｕｄａ逦Ｃ７邋Ｅｌｂｏｗ邋ｅｘｔｅｎｓｏｒｓ逡逑

脊髓损伤,原发性损伤,继发性损伤

１．３脊髓损伤的分类和病理逡逑１．３．１原发性损伤和继发性损伤（二次损伤）逡逑如图１．２所示，ＳＣＩ可分为原发性损伤（ｐｒｉｍａｒｙ邋ｉｎｊｕｒｙ）和继发性损伤逡逑（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ邋ｉｎｊｕｒｙ，又叫二次损伤）。原发性损伤是最初创伤时的物理力的结果，逡逑通常是损伤严重程度最重要的决定因素；所涉及的物理力可包括压缩、剪切、撕逡逑裂和急性拉伸／分离等。继发性损伤是继原发性损伤之后的一种迟发性和进行性逡逑组织损伤，会进一步扩大神经组织损伤的范围，并加剧神经功能缺损６。逡逑图１．２脊髓损伤的分类７逡逑２逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R651.2;TQ427.26

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