毕赤酵母中内切β-1,3葡聚糖酶的表达及水解生产热凝胶寡糖

发布时间：2020-04-21 04:04

【摘要】：热凝胶是一种由土壤杆菌发酵得到的线性水不溶性β-1,3-葡聚糖,分子结构相对简单。本研究室从事热凝胶发酵和性质研究30多年,首次发现了哈茨木霉(Trichoderma harzianum CECT 2413)内切β-1,3-葡聚糖酶可以有效水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖。β-1,3-葡寡糖是一种通过葡萄糖单体以β-1,3-糖苷键连接的低聚寡糖,作为一类新的生理活性物质,功能性寡糖具有抗菌、抗病毒,提高免疫活性等多种生物学功能,在疾病诊断与防治、营养与保健等方面有着很大的应用潜力。但采用哈茨木霉发酵产生β-1,3葡聚糖酶还存在内切酶活性和比例较低,分离纯化步骤繁琐,生产成本较高等问题。本研究首次采用毕赤酵母表达哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因,进一步通过表达条件优化,酶学性质和寡糖水解性质研究,建立了一种酶法高效水解热凝胶制备β-1,3-葡聚寡糖的方法。能够有效降低生产成本,有望替代传统酸水解方法,为规模化酶法制备功能性葡聚寡糖奠定了研究基础,研究结果包含:1.实现了哈茨木霉内切β-1,3-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达。通过全基因技术合成来源于Trichoderma harzianum CECT 2413内切β-1,3-葡聚糖酶序列并构建重组酵母表达载体pPIC9K-BGN13.1,用NcoⅠ线性化重组质粒pPIC9K-BGN13.1,电击转化至毕赤酵母KM71基因组中进行外源表达,通过表型筛选,遗传霉素抗性筛选,经PCR、SDS-PAGE鉴定表明,葡聚糖酶基因整合至酵母染色体DNA中,表达的葡聚糖酶水解热凝胶能够得到聚合度主要为4~6的寡糖。2.对重组酵母的摇瓶发酵条件进行了研究。优化后最适发酵培养基为:1%的酵母膏、2%的胰蛋白胨、0.3%的氯化钙、2%的硫酸镁和2%的磷酸氢二钾,1.34%的100 mM YNB和4×10~(-5)%生物素。优化后最佳诱导摇瓶条件为:诱导培养基初始pH 6.0,接种量2.5%,装液量为500 mL装100 mL发酵液,25℃,220 r·min~(-1),每24 h加入1.5%的甲醇/山梨醇进行诱导,发酵4~5天。发酵上清液中内切β-1,3-葡聚糖酶的蛋白含量和酶活分别是优化前的1.26倍和1.21倍,效果较为明显。3.在7 L发酵罐水平下,针对毕赤酵母在甲醇诱导期,应用了一种低温(25℃)与甲醇/山梨醇共混组合诱导策略来优化外源蛋白的表达。结果表明,采用该组合诱导策略后,最大内切β-1,3-葡聚糖酶的蛋白含量及酶活分别是采用30℃条件下纯甲醇诱导策略时的1.19倍和1.16倍。因此,该组合诱导策略同时提高了外源蛋白的含量和酶活。4.针对发酵上清液纯化后的酶液,研究其酶学性质。研究证明,重组内切β-1,3-葡聚糖酶的最适pH是5.5,最适反应温度为50℃,在pH 4.5~6.5,温度45~60℃的条件下较稳定,相对酶活力在80%以上;Mg~(2+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)对其水解活性能够发挥激活功效;Ca~(2+)、Fe~(2+)对内切β-1,3-葡聚糖酶酶活的影响较小;Hg~(2+)、Ag~+抑制比较明显,其次是Fe~(3+);水解热凝胶制备的寡糖聚合度(degree of polymerization,DP)主要集中在4~6,DP 7~10的寡糖含量较少,葡萄糖、DP 2~3的寡糖几乎没有。
【图文】：

结构图,结构图,微波提取法,来源渠道

图 1-1 功能性多糖结构图Fig. 1-1 The Molecular structure of functional polysaccharide糖有广泛的来源渠道，资源较为丰富，能够直接提取自要有超声波和微波提取法、酶法、酸碱提取法等[7]。目前含酵母葡聚糖与昆布多糖。酵母β-1,3-葡聚糖是酵母细胞

直链,寡糖,消化吸收,能量值

图 1-3 直链β-1,3-葡寡糖Fig. 1-3 Molecular structure of liner β-1,3-glucooligosaccharides糖很难被人体消化吸收，，其提供的能量值不高，因此常用
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ929.2

【参考文献】