核桃抗菌肽的制备及抑菌活性研究

发布时间：2020-04-21 20:37

【摘要】：核桃粕是核桃仁经压榨后的废弃物,常被作为饲料使用,附加值低。核桃粕蛋白质含量较高,利用核桃粕开发具有较高生物活性的深加工产品,具有十分重要的意义。本论文以核桃粕为原料,筛选特定的蛋白酶对核桃蛋白进行水解,获得具有抑菌功能的抗菌肽,对抗菌肽分离纯化,获得氨基酸序列及来源蛋白质等信息,在此基础上,对抗菌肽的抑菌稳定性及抑菌机理进行初步探讨,具体实验内容及实验结果如下:1.优化核桃抗菌肽制备工艺以酶解液的抑菌活性为评价指标,筛选适宜的蛋白酶作为酶解核桃蛋白的最优蛋白酶。研究结果显示:胃蛋白酶水解核桃蛋白得到的多肽,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的生长具有一定的抑制作用。基于上述研究,以水解度为评价指标,采用响应面试验设计优化胃蛋白酶酶解核桃蛋白最佳工艺条件。结果显示:温度为54.11℃,pH为3.46,加酶量为5475.71U/g,水解度最优,可达13.99%。2.核桃抗菌肽分离纯化将得到的酶解液按分子量大小(3KDa、10KDa、30KDa)进行超滤处理,对不同分子量大小的多肽抑菌活性进行测定,筛选出分子量在3-10KDa范围的多肽(H-II)抑菌活性较优,采用反相高效液相色谱法对该分子量范围的多肽进行分离纯化,得到7种具有抑菌活性的多肽组分(H-II-1～H-II-7),其中组分H-II-6抑菌效果最优,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有显著的抑制作用。3.抗菌肽H-II-6氨基酸序列研究利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、四极杆-轨道阱液质联用(QE-MS)技术及Sprot数据库提供的植物源抗菌肽序列信息,研究抗菌肽H-II-6分子量及氨基酸序列信息。研究结果表明:H-II-6抗菌肽的分子量为3772.7359Da,序列推测为 Thr-Gly-Ger-Gla-Val-Pro-Ger-Pro-Arg-Gla-Ger-Gla-Thr-GlaThr-Met-Glu-Met-Gla-G la-Gla-M et-Gly-Leu-M et-Pro-Gly-G er-Pro-G er-G er-Val-Ger-Gla-Val-Met-Ger-Pro-Phe,疏水性氨基酸有脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸,约占氨基酸总数的50%,长度为39个氨基酸,所属蛋白质的序列编号为Q10EL1。4.H-II-6抗菌肽抑菌稳定性及机理初探研究了H-II-6抗菌肽在紫外照射、不同pH、不同温度条件下的抑菌稳定性,同时从菌体细胞形态方面探讨了H-II-6抗菌肽对三种细菌的作用机制。研究结果表明:pH在5.0-9.0范围内,随pH的增大,H-II-6抗菌肽的抑菌活性降低,抑菌圈直径差异显著(p0.05);在40-121℃温度范围,H-II-6抗菌肽的抑菌活性变化差异不显著(p0.05);紫外线照射1h内,组分H-II-6对菌株的抑制作用变化不显著(p0.05)。因此,H-II-6抗菌肽对紫外线和温度具有较好的抑菌稳定性。H-II-6抗菌肽可以使金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的菌体细胞发生不同程度的表面凹陷、断裂以及细胞破碎,从而实现对细菌生长的抑制作用。
【图文】：

选取底物浓度３ｇ／１００ｍＬ，邋ｐＨ值３．０，温度５０°Ｃ，酶解时间４ｈ，以水解度为评价逡逑指标，分别在３０００Ｕ／ｇ、４０００Ｕ／ｇ、５０００Ｕ／ｇ、６０００Ｕ／ｇ的条件下对核桃蛋白进行酶解逡逑实验，加酶量与水解度的变化情况如图２－１所示。逡逑１４邋－逦ｄ逡逑，，２．逦Ａ＾逡逑／逡逑一邋１０邋－邋／逡逑ｔ逦／逡逑＾邋８－逦ｙ逡逑％逡逑？邋６－邋／逡逑４邋－邋Ｙ逡逑３０００邋３５００邋４０００邋４５００邋５０００邋５５００邋６０００逡逑加酶量⑴／ｇｊ逡逑图２－１加酶量对水解度影响逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ邋ｏｎ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ａｄｄｉｔｉｏｎ逡逑由图２－１可知，当加酶量在３０００－５０００Ｕ／ｇ时，水解度随着酶添加量的增加而提逡逑１５逡逑

选取ｐＨ值为３．０，温度５０°Ｃ，酶解时间４ｈ，酶浓度５０００Ｕ／ｇ，以水解度为评价逡逑指标，分别在２ｇ／１００ｍＬ、３ｇ／１００ｍＬ、４ｇ／１００ｍＬ、５ｇ／１００ｍＬ的条件下对核桃蛋白进逡逑行酶解，底物浓度与水解度的变化情况如图２－２。逡逑１４邋－逡逑１２邋－逦Ｊ逦ｃ逡逑１０邋－逡逑２邋８－逡逑鹋／逡逑Ｒ４ｒ邋６邋－逡逑芩４：逡逑２邋－逡逑0邋２．０逦２．５逦３．０逦３．５逦４．０逦４．５逦５．０逡逑底物浓度（％）逡逑图２－２底物浓度对水解度影响逡逑Ｆｉｇ．邋２－２Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ邋ｏｎ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ逡逑由图２－２可知，当底物浓度在２％－３％时，随着底物浓度的增大，水解度增大，但逡逑整体上升趋势平稳，当再增大底物浓度时，水解度开始下降。底物浓度较低时，自由逡逑水含量较多，有利于分子在溶液中扩散，酶与底物结合几率较大，水解度升高，而高逡逑浓度的核桃蛋白会对酶形成抑制作用；并且考虑低碳经济，提高效率；因此，确定核逡逑桃蛋白的底物浓度为３％。逡逑２．４Ａ３邋ｐＨ的影响逡逑选取酶解温度５０°Ｃ，提取时间４ｈ，酶浓度５０００Ｕ／ｇ，底物浓度３ｇ／１００ｍＬ，以水逡逑解度为评价指标，分别在ｐＨ２．０、ｐＨ３．０、ｐＨ４．０、ｐＨ５．０的条件下对核桃蛋白进行酶逡逑解，ｐＨ与水解度的变化情况如图２－３。逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TS202.3;TS229

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本文编号：2635710