α-氨基酸酯酰基转移酶工程菌构建、表达及其催化合成丙谷二肽的研究

发布时间：2020-04-28 01:12

【摘要】：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)因其具有高热稳定性、高水溶性并且无生理毒性,常被作为L-谷氨酰胺的载体应用于临床。α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能够催化底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成丙谷二肽。本文构建了一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌,并对其发酵条件、酶学性质及催化应用进行了研究。本论文首先将来源于E.brevis ATCC 14234和siyangensis AJ2458的α-氨基酸酯酰基转移酶的编码基因进行密码子优化,然后经全基因合成并将其导入到不同的质粒载体,构建了SAET-QC01、SAET-QC02、EAET-DW01三组重组菌株,其中SAET-QC01的产量显著高于其他菌株,更适合α-氨基酸酯酰基转移酶的表达。其次对SAET-QC01的发酵条件经优化确定为:甘油0.5%、胰蛋白胨0.5%、酵母浸粉1%、无水硫酸镁0.1%、初始pH 6.3,诱导温度为20℃,诱导初始菌浓OD_(600)=2.0-2.5,IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间12 h,优化后酶活力从221.6 U/mL提升到998.0 U/m L,提高了将近5倍。通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组蛋白,测定其分子量约为68 k Da。研究该酶的酶学性质发现其最适温度为27℃,最适p H 8.5,在p H 7.0-8.0很稳定,在酸性条件下相对稳定;金属离子及化合物对该酶活力有一定的影响,在一定浓度范围内,低浓度的Co~(2+)和低浓度的EDTA对酶活有促进作用,高浓度的Fe~(3+),Ni~(2+),SDS对该酶有明显的抑制作用;并测得该酶的Km和Vmax的值分别为0.30 mol/L和0.02 mol/min·g。再对其催化应用进行了初步的探索,利用重组α-氨基酸酯酰基转移酶制备丙谷二肽,在加酶量为50 U/mmol,底物谷氨酰胺和丙氨酸甲酯盐酸盐的添加比例为0.8,当丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L,丙谷二肽的产量分别为15.1 g/L,29.2g/L、42.3 g/L、56.2 g/L、69.5 g/L、78.2 g/L,相对于谷氨酰胺的转化率为86.7%,84.0%,81.1%,80.9%,80.0%,75.0%。最后将催化产物进行初步的分离纯化,并对其进行了结构表征,确定了丙谷二肽的结构特点。本论文研究确定α-氨基酸酯酰基转移酶具有良好的酸碱耐受性,催化效率高的优良特性,在工业生产中具有较好的应用潜力。
【图文】：

实验流程

实验流程设计

质粒图谱,上海,氨基酸酯,酰基转移酶

第二章 -氨基酸酯酰基转移酶重组工程菌的构建构建询比对，来源于 E. brevis ATCC 14234 的2458 的编码 SAET的基因，在构建大肠杆达可能不适合，，所以根据大肠杆菌的密码优化目标为根据大肠杆菌表达的密码子偏等。将序列送至生工生物工程（上海）股基因合成工作。8a-SAET 的构建程（上海）股份有限公司构建的重组质粒pUC57-SAET 质粒图谱如图 2.1 所示。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925;TQ464

【参考文献】