蚓激酶工程菌的构建及发酵过程控制

发布时间：2020-05-03 15:50

【摘要】：蚓激酶(Lumbrokinase,LK)是蚯蚓体内发现的一组同时具有纤溶活性和激酶活性的丝氨酸蛋白酶。该酶能够刺激纤溶酶原转变成纤溶酶,从而催化纤维蛋白,起到溶血栓作用。该酶稳定性良好,其酶制剂既能口服,亦可注射,现已广泛应用。目前蚓激酶基因已在真菌、细菌和动物细胞中成功进行表达,但表达效果不够理想。本论文从土壤中筛选得到野生蚯蚓,鉴定为赤子爱胜蚓,并克隆得到蚓激酶基因lks2。以乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母为宿主,成功构建重组菌GG799-p KLAC1-lks2和GS115-p PIC9K-lks2。通过高密度发酵及过程控制,成功实现蚓激酶在毕赤酵母中的高表达,最高酶活达1140.8 U/m L。主要研究工作如下:(1)从校园土壤中筛选得到野生蚯蚓,利用分子生物学鉴定为赤子爱胜蚓。提取蚯蚓总RNA并进行反转录得到c DNA,克隆得到蚓激酶基因lks2。利用DNAMAN等生物信息学软件对基因分析,该基因全长738 bp,共编码245个氨基酸,与已报导F238(Gene Bank No.DQ202401)基因同源性为99.59%,其中第136、175和398位碱基不同,导致编码的46和59位氨基酸发生差异。对蚓激酶LKS2进行分子建模和底物对接,预测得到该酶的催化活性中心(Tyr167-Ile218-Gly219-Asp189-Gly219)。(2)成功构建重组质粒p KLAC1-lks2,实现蚓激酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799中的表达。经优化确定重组菌最佳培养基为:葡萄糖25.0 g/L、酵母粉10.0 g/L、蛋白胨20.0 g/L、KH2PO4 10.0 g/L。此条件下产酶效果最佳,酶活在72 h达到峰值140.4 U/m L。(3)构建载体p PIC9K-lks2,实现蚓激酶基因lks2在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达。经优化确定最佳诱导条件为:初始菌体量OD600=1.5,p H 5.5,温度28℃。此外,添加0.1%的丝氨酸能有效提高重组菌产酶能力。在最佳条件下,经甲醇诱导84 h,蚓激酶活力达到峰值为397.6 U/m L,较优化前提高了56.3%。(4)在摇瓶优化基础上,利用10 L发酵罐对重组菌GS115-p PIC9K-lks2进行高密度发酵条件优化,确定最佳菌体接种浓度为9±0.5 g/L。此外,添加0.5%酵母浸粉能够促进产酶。经发酵过程控制,蚓激酶活力最高达1140.8 U/m L,较优化前的前期培养时间缩短11.5 h,酶活提高1.16倍。
【图文】：

电泳图,蚯蚓,基因组,电泳图

图 2-1 蚯蚓基因组电泳arthworm genome electro单一条带，，分子量大小图 2-2 18SrDNA 电泳图2 18SrDNA electrophores

电泳图,电泳图,蚯蚓,分子量大小

8SrDNA电泳图
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925

【参考文献】