易错PCR全基因组改组筛选耐糠醛的运动发酵单胞菌

发布时间：2020-05-06 21:04

【摘要】：化石燃料的储备量急剧下降,温室效应日益加剧,清洁能源纤维素乙醇成为各国的研究热点。纤维素乙醇以木质纤维素为原料,木质纤维素预处理产生的抑制物尤其是糠醛会严重抑制菌株的生长和产醇。运动发酵单胞菌因其具有众多良好的特性成为生产乙醇的优势菌株,但是其生长和产醇也会受到糠醛的严重抑制,因此,获得具有糠醛耐受性的运动发酵单胞菌对工业乙醇的生产有着重要的意义。本次研究以运动发酵单胞菌CP4为出发菌种,首次尝试易错PCR全基因组改组技术改造该菌种,获得了糠醛耐受突变体F211和F27。3 g/L糠醛胁迫下,突变体F211和F27的最大细胞密度比CP4高140-149%,且达到最大细胞密度所需的时间比CP4快约16 h,突变体的乙醇得率比CP4高115-118%,并且突变体具有稳定遗传的糠醛耐受性。在2 g/L和3 g/L糠醛条件下,突变体F211和F27生长和发酵均快于出发菌株CP4,1 g/L糠醛为抑制菌株生长和发酵的最小浓度。葡萄糖浓度为15-20%(w/v)的培养基中,突变体F211和F27的生长和产醇速率显著快于出发菌株,说明糠醛耐受突变体同时具有高浓度葡萄糖糖耐受性。突变体的糠醛还原酶活性显著高于出发菌株CP4,说明突变体通过加速糠醛还原而提高其糠醛耐受性。重测序表明突变体F211和F27分别有12和13个位点发生突变。突变基因功能的初步研究表明转录调节因子基因缺失菌株CP4-△1431糠醛耐受性和糠醛还原酶活性均提高;外排转运蛋白基因缺失菌株CP4-△0525糠醛耐受性降低。上述结果表明突变体F211和F27可能通过调节糠醛还原酶基因的表达,加速糠醛的还原和外排来提高菌株的耐受性。综上所述,首次使用易错PCR全基因组改组技术改造运动发酵单胞菌,并获得了耐受糠醛、且遗传稳定的突变菌株,为运用该技术快速高效改善运动发酵单胞菌对纤维素水解液抑制物的耐受性提供了基础。突变体糠醛耐受性的关键突变位点的功能鉴定为阐明该菌糠醛耐受的机制、运用反向代谢工程构建耐受菌株奠定了基础。
【图文】：

-1 以 Z.mobilis CP4 基因组为模板得到的易错 PCR 产物电泳图 the electrophorogram of ePCR products amplified from Z.mobililis CP4 的基因组。图 b 和 c 为易错 PCR 产物。P4 的基因组，大小 2 M；泳道 2：Marker D15000 (TIANGE)， bp; b: 3-6 泳道：不同引物组合的 PCR 产物，引物组合为 1 15 mer (6.6 μL) 和14 mer (10 μL), 12 mer (16.6 μL), 15 mer (1r Ⅲ（ TIANGE）；8 泳道：PCR 产物纯化并浓缩 20 倍之后下依次是 4500 bp、3000 bp、2000 bp、1200 bp、800 bp、500ome of CP4; lane 2: Marker Ⅲ(TIANGE); b: lane 3-6: PCR pro12 mer (6.6 μL) and 10 mer (10 μL), 15 mer (6.6 μL) and 14 m mer (16.6 μL); lane 7 and 9: Marker Ⅲ(TIANGE); c: lanurified PCR products. The band size of DNA marker Ⅲ is 450800 bp, 500 bp, 200 bp, respectively.

图 3-2 转化子在 含 3 g/L 糠醛的 RM 培养基里的生长评价Figure 3-2 Growth curves of transformants in RM with 3 g/L furfural.2 以 F2-1 为出发菌株的第二轮全基因组改组经第一轮改组在含 2 g/L 糠醛的 RM 固体平板上筛选出耐受糠醛。为了进一步提高 F2-1 的糠醛耐受性，进行了第二轮的全基因组2-1 的基因组，以其基因组为模板，利用最佳随机引物组合 15 mer (er (10 μL), 12 mer (16.6 μL)进行易错 PCR，，易错 PCR 产物浓缩 20运动发酵单胞菌 F2-1 的感受态细胞，复苏 16 h，将菌液适当稀释糠醛浓度为 2.3 g/L、2.5 g/L 和 2.7 g/L 的 RM 平板上，30 ℃倒置培养菌落直径较大的转化子，预培养后在 3 g/L 糠醛，4 mL（25 mL 螺旋M 培养基初步筛选，获得了 6 个生长好于野生型的转化子。进一步转化子在 100 mL 含 3 g/L 糠醛的 RM 培养基中培养。18 h 后，转化
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ223.122;TQ920.6

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本文编号：2651854