林蛙骨肉多肽螯合钙的制备表征及吸收特性的研究

发布时间：2020-05-07 01:54

【摘要】：林蛙,在我国主要分布在东北三省,是一类十分有名的蛙科,它具有很高的价值,主要是食补、保健、美容以及经济药用价值等。但是,目前在市场上林蛙的加工利用度极低,导致以林蛙为原料的产业,如饮食业、医药行业、保健品等行业产品的开发和生产严重滞后,造成目前市场上销售的林蛙产品仍以林蛙油制品为主。林蛙油只占雌蛙的15%左右,其余约85%的雌蛙骨肉残体和全部的雄蛙都无法得到有效的利用,它们只有部分作为动物饲料,绝大部分作为废弃物丢弃,造成了资源的极大浪费和环境的严重污染。因此,本实验以东北特有的林蛙骨肉为原料,以水解度和多肽得率为指标,进行林蛙骨肉酶解工艺的优化;再以螯合率为指标,优化酶解液与CaCl_2的螯合工艺;接下来设计Caco-2细胞模型,从细胞学角度探讨林蛙骨肉多肽螯合钙相对其他补钙剂的吸收特点;最后为制成林蛙骨肉的相关产品,以综合评分为指标,优化螯合钙片剂的配方工艺。主要的研究结果如下:(1)林蛙骨肉酶解工艺的研究:以水解度和多肽得率为指标,分别以碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶这5种酶,在一定条件下制备林蛙骨肉多肽液,最终确定胰蛋白酶的水解效果最好,水解度18.77±0.374%,多肽得率34.66±0.348%。考察水解时间、水解温度、加酶量、pH,对林蛙骨肉多肽水解效果的影响,利用L_9(3~4)正交试验对林蛙骨肉多肽的提取条件进行优化,最优酶解条件为:加酶量5000 U/g,pH值8,温度45℃,时间4 h,此时的水解度为21.34±0.017%,多肽得率40.11±0.043%。在最优工艺下,制得林蛙骨肉多肽液。把多肽液制成冻干粉,检测冻干粉的理化性质,结果显示,在210 nm处有多肽的紫外特征吸收峰,通过傅里叶红外光谱检测,在1538 cm~(-1)处有多肽的特征官能团,表明成功制备出了林蛙骨肉多肽粉。(2)林蛙骨多肽螯合钙的制备及表征:以林蛙骨肉多肽液和CaCl_2为原料,在一定条件下制备多肽螯合钙,以螯合率为指标,考察螯合温度、时间、肽钙比、无水乙醇添加倍数这四个因素对螯合率的影响。采用单因素响应面试验研究分析,从而可以确定最优的工艺,螯合条件为:时间为30 min,温度为30℃,肽钙比(多肽液的体积与加入氯化钙质量的比值)为10:1(ml/g),无水乙醇的添加倍数为8,螯合率达到79.43±0.065%。将制得的多肽螯合钙结构进行分析,分析方法采用紫外光谱、傅里叶红外光谱、扫描电镜,从而推测了多肽螯合钙的结构。结果显示,利用紫外、红外光谱进行分析后,能够明显的看出多肽和螯合钙在化学结构上发生一定的变化;利用扫描电镜分析后,可以清晰的看到较多“白色晶体”镶嵌在多肽螯合钙表面。以上结果均表明了多肽与钙形成了新的螯合物。(3)林蛙骨肉多肽螯合钙吸收特性的研究:采用Caco-2细胞模型,通过MTT法检测细胞的存活率,从而构建细胞模型。再以CaCl_2,葡萄糖酸钙,CCP-Ca为对照组,从细胞学角度探讨和了解林蛙骨肉多肽螯合钙相对其他补钙剂的吸收特点。林蛙骨肉多肽螯合钙会对细胞的存活产生一定的影响,加入过量会影响细胞的存活,当林蛙骨肉多肽螯合钙的加入量高于0.5 mg/ml时,细胞的存活率显著降低。林蛙骨肉多肽螯合钙与CCP-Ca在细胞的吸收方面效果相似,并且优于CaCl_2和葡萄糖酸钙。(4)林蛙骨肉螯合钙片剂的制备工艺:采用湿法造粒进行林蛙骨肉多肽螯合钙片剂的制备。结果选定的林蛙骨肉多肽螯合钙片剂的辅料为:填充剂为微晶纤维素,矫味剂为山梨糖醇,酸味剂为苹果酸。以片剂的综合评分为指标,通过单因素响应面试验得出片剂辅料的最佳配方为:填充剂(微晶纤维素)的添加量为30%,矫味剂(山梨糖醇)的添加量为45%,酸味剂(苹果酸)的添加量为5%。片剂制备中添加的其他配方为:崩解剂(交联羧甲基纤维素钠)的添加量为7%,润滑剂(硬脂酸镁)的添加量为3%,林蛙骨肉多肽螯合钙的添加量为20%。得到的片剂外观为圆状,表面光滑,乳白色,色泽均匀;口感上无腥味,奶香适宜,酸甜可口,软硬适中,没有颗粒感。
【图文】：

标准曲线,多肽,标准曲线,制作标准

使它们均匀混合好，静置 30 min 后，取上清液于 540 nm 处测 OD 值，制作标准曲线。如图2.1。图 2.1 多肽标准曲线Fig 2.1 Peptide standard curve

营养成分分析,林蛙,水解度,蛋白酶

图 2.2 林蛙骨肉粉营养成分分析图Fig 2.2 Rana bone flesh nutrient composition analysis蛋白酶的筛选解法便于控制且条件温和，由于蛋白酶具有专一性和选择性，可以条件制备出肽。以水解度和多肽得率为指标，使用 5 种蛋白酶酶解 2.3 所示，可以看出在胰蛋白酶水解条件下，水解度为 18.77±0.37为 34.66±0.348%，能同时达到最高，，因此选用胰蛋白酶为最佳的林解酶。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ460.1;TS201.4

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