氮源调控丙酮丁醇梭菌合成丁醇的机制研究

发布时间：2020-05-07 01:55

【摘要】：丁醇是一种有机溶剂,广泛应用于各行各业。生物丁醇是丙酮丁醇梭菌以淀粉类物质为原料经ABE发酵的产物。目前国内外主要以碳源为出发点,试图寻求廉价碳源以降低生产成本,与氮源相关的研究较少。故本研究以氮源为基础优化发酵培养基,以期降低生产成本,同时解析氮源调控ABE发酵的机制,奠定氮源对丁醇产量影响的理论基础。本研究以实验室保存的丙酮丁醇梭菌为研究对象,考察氮源种类对ABE发酵的影响,并结合单因素和Box-Behnken实验,确定发酵最优培养基为:木薯粉80.0g/L、豆粕10.9g/L、碳酸钙1.8g/L、硫酸锌 0.34g/L,K2HPO4-KH2PO4(1:1)0.5g/L。在最优培养基下,丁醇与总溶剂产量分别达到15.69 g/L和26.32 g/L,与优化前相比提高了 52.03%和 55.73%。在前期的工作中,发现:豆粕可显著提高溶剂产量,而乙酸铵则可缩短发酵时间。因此,探究添加豆粕-乙酸铵复合氮源是否可进一步提高ABE发酵效率。然而,无论是以木薯粉还是葡萄糖为碳源,复合氮源的添加会抑制约30%的丁醇产量。通过进一步发酵实验,发现乙酸铵中的NH4+是主要的抑制因子。NH4+的引入使丁醇与总溶剂产量比对照组分别降低了 90.28%和90.81%,总溶剂产量/葡萄糖利用量仅为0.090 g/g,严重影响溶剂产量及得率。为进一步研究NH4+在有机氮源存在的情况下调控ABE发酵的生理机制,从胞内微环境(NADH/NAD+、pH)、酶学水平以及转录水平多方面解析NH4+的抑制机理。最终明确乙酸铵为唯一氮源可缩短发酵时间,而在有机氮存在的情况下,NH4+将抑制NADH的利用,抑制丁酸乙酰乙酸酯CoA转移酶的酶活性并且使基因askA、buk、adc、ctfA、adhE以及bdhB表达量下调,进而抑制ABE发酵。
【图文】：

氮源浓度,豆粕,木薯粉

２．５．１．２氮源浓度的确定逡逑豆粕作为大豆提油后的副产品，近年来价格持续走低。对于工业化而言，低逡逑生产成本意味着高经济效益。由图２－１可知，随着豆粕浓度的增加，丁醇与总溶逡逑剂产量不断增加，增幅则是先增加后降低。相比于对照组，添加１0邋ｇ／Ｌ豆粕，逡逑丁醇与总溶剂产量可达１１．１５邋ｇ／Ｌ和１７．５８邋ｇ／Ｌ，提高５．４９倍以及７．１３倍。然后逡逑随豆粕浓度的增加，丁醇与总溶剂的增幅开始不断降低，当豆粕浓度为２０ｇ／Ｌ逡逑时其增幅仅为２．６８％，此时豆粕浓度的增加对于溶剂产量作用不大。因此，从低逡逑成本高效益的角度而言，，工业化生产时豆粕的浓度可以选择为１0邋ｇ／Ｌ。逡逑ｒ￣ｉ丙搦产Ｉ逡逑２４邋（？逦＿乙醉产ａ逡逑ｒｉ邋ｒ？邋产邋ａ逡逑＆灥产ｉ逡逑ｉｔｒ逦＿逦W逡逑Ｉ＇２＇逦｜邋；｜邋Ｉ逡逑Ｉ邋Ｉ逦Ｉ逡逑０逦Ｉ－邋５逦５逦１０逦２０逡逑Ｓ柏浓度％；Ｌ）逡逑图２－１氮源浓度对产量的影响逡逑Ｆｉｇ邋２－２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｎｉｔｒｏｇｅｎ邋ｓｏｕｒｃｅ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｎ邋ｙｉｅｌｄ逡逑２．５．１．３碳源浓度的确定逡逑碳源的浓度直接影响工业化的生产成本，故考察不同浓度的木薯粉对于逡逑ＡＢＥ发酵的影响。由图２－２可知，随木薯粉浓度的增加，溶剂产量也随之增加。逡逑但是木薯粉的浓度增加到一定值后

木薯粉,浓度,碳酸钙,溶剂

２．５．１．４碳酸钙浓度的确定逡逑研究表明，ＣａＣ０３既可充当缓冲剂调节发酵液中的高ｐＨ值，又可平衡产酸逡逑期时的ＮＡＤＨ和ＡＴＰ［７８＝７９］，从而促进溶剂生产。由图２－３可知，碳酸钙的添加逡逑均可促进溶剂生产。随碳酸钙浓度的增加，溶剂产量也不断增加，但超过２邋ｇ／Ｌ逡逑时，产量又随浓度的增加而减少。额外添加２邋ｇ／Ｌ碳酸钙，丁醇与总溶剂产量可逡逑以达到１５．０５邋ｇ／Ｌ和２２．６８邋ｇ／Ｌ，比对照组提高了邋３０．５３％以及２９．８２％。逡逑ＣＺＩ内？产摄逡逑２５邋－逦乙酵产１逡逑—Ｉ丁ｇ产最逡逑丨邋ＨＢ：＇洛剂产罱逡逑．ｍｉｌｌ逡逑０逦０？邋５邋Ｊ逦２逦３逦４逦５逡逑碳酸钙浓度（ｇ／Ｌ＞逡逑图２－３碳酸钙浓度对产量的影响逡逑Ｆｉｇ邋２－３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＣａＣ0３邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｎ邋ｙｉｅｌｄ逡逑２．５．１．５缓冲盐浓度的确定逡逑由图２－４可知，磷酸缓冲盐溶液的添加对于溶剂产量有促进作用。丁醇与总逡逑溶剂产量随着磷酸盐缓冲液浓度的增加而增加，但是当Ｋ２ＨＰ0４－ＫＨ２Ｐ０４的浓度逡逑１９逡逑
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ923

【参考文献】