重组乳杆菌放大生产最佳发酵时间的研究

发布时间：2020-05-08 04:00

【摘要】：对于微生态制剂的工厂化生产,确定重组乳杆菌放大生产最佳的发酵时间具有非常重要的意义,一方面可以保证产品质量,另一方面可以减少成本。因此,本研究利用传统的干酪乳杆菌放大培养基MRS培养基对重组ETEC K99和重组PEDV-S1干酪乳杆菌进行摇瓶培养和发酵罐生产,采用荧光定量PCR检测重组质粒的拷贝数,利用流式细胞术检测目标蛋白表达菌数,探究质粒拷贝数与目标蛋白表达菌数之间的相关性,确定放大培养的最佳发酵时间。首先,通过发酵重组干酪乳杆菌,绘制重组干酪乳杆菌的生长曲线,确定其生长的最佳时期。之后,将p LA-K99/L.casei与p LA-PEDV-S1/L.casei分别接种至添加抗生素和不添加抗生素的MRS培养基中传代培养,进行稳定性实验。我们使用荧光定量PCR方法检测重组干酪乳杆菌中质粒的拷贝数,使用流式细胞术检测乳酸菌的目标蛋白表达菌数。结果表明两株重组菌在摇瓶8 h达到生长顶点,传至120代时外源质粒并无丢失情况出现。p LA-K99/L.casei的质粒拷贝数在8 h达到峰值31.12,表达目标蛋白的重组菌在8 h达到峰值98.64%,p LA-PEDV-S1/L.casei的质粒拷贝数在8 h达到峰值29.97,表达目标蛋白的重组菌在7 h达到峰值92.76%。两株重组乳酸菌进行200 L发酵罐放大培养的检测结果表明,与摇瓶发酵相比,发酵罐发酵可以提高细菌数量,质粒拷贝数及目标蛋白表达菌数的结果与摇瓶发酵结果一致。以上试验结果显示了在细菌生长的对数生长期末期,质粒拷贝数和目标蛋白表达菌数最多。在衰亡期,随着发酵时间的增加,质粒拷贝数逐渐减少,目标蛋白表达菌数也在相应减少。因此,重组乳杆菌在对数生长期质粒拷贝数与目标蛋白表达量之间存在着正相关性,发酵的最佳时间是6~10 h。重组乳杆菌可以进行工厂化发酵生产。
【图文】：

溶解曲线,工作原理,染料

状态下不发荧光（见图 1-1），所以反应的初期是检测不到荧光信号的[续，结合到 DNA 双链上的染料越来越多，在特定的阈值下就可以检测未结合的染料不会发出荧光，所以荧光信号的增加与 PCR 的扩增反应是BR Green I 染料的优点在于操作方便，通用性好，，应用范围宽泛不受制约的序列设计对应的引物，并且与探针法相比省时省力，价格便宜，方便但是缺点在于它的不特异性，荧光染料可结合体系中的物质，包括 dsDN错误的产物，造成假阳性的结果几率大。所以在使用染料做实验时，在结合溶解曲线来分析数据的可靠程度，避免实验过程中的不确定因素，干扰。

工作原理,检测方法

图 1-2 TaqMan 工作原理Figure 1-2 TaqMan working principle测方面的应用菌和霉菌污染室内环境被认为是一个公共健康问题。室内空气了解房屋真菌与呼吸道问题之间联系的常用工具。Libert X[50 绿色实时 PCR 检测方法，用于杂色曲霉的特异性检测和鉴定环境中的过敏原。断方面的应用开发了许多基于荧光探针的实时 RT-PCR 分析来检测病毒。步 SYBR Green I 实时 RT-PCR 方案检测 IBV N 基因。Jiang W Green I 的单步定量 qRT-PCR 检测方法，以 HTNV 基因组的 S定量。它是一种灵敏，特异，可重复且简单的方法来检测定量
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.6

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