齐整小核菌积累硬葡聚糖的发酵过程优化

发布时间：2020-05-09 16:57

【摘要】：硬葡聚糖(Scleroglucan)是丝状真菌中小核菌属合成分泌的微生物多糖,其中以齐整小核菌最为典型。为进一步提高硬葡聚糖产量,降低硬葡聚糖的生产成本,以本研究室获得的一株野生型齐整小核菌菌株(Sclerotium rolfsii WSH-G01)为研究对象。在摇瓶水平上对培养基成分和培养条件进行单因素优化,结合响应面分析得到最适发酵培养基组成及发酵培养条件,在3 L发酵罐上对硬葡聚糖分批发酵过程中营养成分和发酵条件进行了优化。最后对硬葡聚糖的理化性质和水解条件进行初步分析。本文主要研究内容如下:(1)通过测定生长曲线确定该齐整小核菌的最佳接种种龄为72 h。单因素优化实验和响应面分析优化了培养基中的关键因子(葡萄糖、酵母膏、NaNO_3、培养时间)对硬葡聚糖积累的影响。获得最适发酵培养基组成及培养条件:葡萄糖55.0 g·L~(-1),酵母膏0.5g·L~(-1),NaNO_3 2.5 g·L~(-1),培养时间5 d,初始pH 4.0,接种量5%,250 m L摇瓶装液量50mL。在30℃,220 r·min~(-1)条件下培养120 h,硬葡聚糖产量11.8 g·L~(-1)。(2)在3 L发酵罐上对初始葡萄糖浓度(35 g·L~(-1)、55 g·L~(-1)、75 g·L~(-1)、95 g·L~(-1)),搅拌转速(200 r·min~(-1)、400 r·min~(-1)、600 r·min~(-1)),通气量(0.5 vvm、1 vvm、2 vvm、3 vvm)和补料发酵策略(一次性、恒速流加、恒定浓度补料)进行优化。确定最适的初始葡萄糖浓度为75 g·L~(-1),搅拌转速400 r·min~(-1),通气1 vvm,最佳补料策略为发酵40 h将葡萄糖浓度恒定在65 g·L~(-1)补料32 h,在此最优条件下硬葡聚糖产量最高达到34.5 g·L~(-1),细胞干重达到20.7 g·L~(-1),生产强度达到0.48 g·L~(-1)·h~(-1),底物利用率为30%。(3)初步分析冷冻干燥获得的多糖样品,研究了多糖纯度和多糖结构。确定硬葡聚糖为纯度96.2%,由葡萄糖分子组成,重均分子量在1.9×10~7 Da的β-葡聚糖。在此基础上,研究了酸水解和β-1,3葡聚糖酶水解硬葡聚糖后的分子量分布。0.1 M HCl酸水解后多糖的重均分子量分布为65185、5048、1061、217 Da。构建四个不同来源的β-1,3葡聚糖酶基因BGLM,PGLA,EXG1,BGLF表达载体诱导获得粗酶液水解硬葡聚糖,水解温度为37℃时硬葡聚糖水解重均分子量为20 kDa左右,30℃时水解重均分子量为200 kDa左右。
【图文】：

硬葡聚糖,草酸盐,生物合成途径,副产物

江南大学硕士学位论文(1) 细胞内多糖，用于储存细胞的碳或能量；(2) 结构性多糖，是组成部分细胞结构或细胞壁的组成部分；(3) 胞外多糖，属于微生物次级代谢产物，是重要的致病因子，其功能主要包括 1) 有利于菌体吸附寄主和吸收营养；2) 有助于菌体抵御干燥的损害。微生物发酵法能产生大量的微生物多糖，这些胞外多糖可以从发酵液中回收，具有较大商业化潜力。在微生物系统遵循多糖的生产的一般途径，硬葡聚糖生物合成被假定为有三个步骤：(1) 底物摄取，(2) 细胞内形成，(3) 分泌到胞外[31]。小核菌硬葡聚糖生物合成途径遵循一般的葡萄糖基胞外多糖的合成代谢途径：胞外葡萄糖被葡萄糖转运蛋白吸收并通过己糖激酶(1) 磷酸化反应行成葡萄糖-6-磷酸；葡萄糖-6-磷酸在磷酸葡萄糖变位酶(2) 作用下异构化成葡萄糖-1-磷酸；葡萄糖-1-磷酸经 UTP 葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(3) 作用形成UDP-葡萄糖；β-1,3-D-葡聚糖合酶(4) 以UDP-葡萄糖作为底物形成β-1,3-D-葡聚糖。最后，糖基转移酶/葡糖苷酶(5) 将含有 β-1,6 键连接的葡糖基连接到以 β-1,3 键连接的主链上[20]。

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江南大学硕士学位论文程液 5 mL 加入两个相同试管中，取 5 mL 0以 0.2MNaOH 溶液为对照，30°C 和 37°C PC 测定分子量分布。糖含量糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅色化合物，再以比色法测定[69]。葡萄糖标7X-0.03842，R2=0.995，，表明葡萄糖含量。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ929.2

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