组合型层析配基的设计优化及抗体分离性能研究
发布时间：2020-05-14 16:10
【摘要】：随着生物医药技术的发展,抗体药物在医药领域的应用越来越广泛。抗体药物的下游分离工艺作为抗体药物生产的重要环节在近年内发展较为缓慢。目前应用较广的蛋白A亲和层析介质在具有高亲和力和选择性的同时也存在抗体洗脱条件苛刻和配基易脱落等局限。本论文通过计算机模拟的方法研究蛋白A和抗体间的相互结合过程,分析蛋白A中关键氨基酸残基,设计构建高选择性的仿生短肽配基并结合疏水电荷诱导配基,研究开发具有高选择性及温和洗脱条件等特点的组合型抗体分离配基,为新型配基的设计和抗体分离提供新的思路和方法。首先通过分子动力学模拟研究了蛋白A和抗体Fc片段之间的结合模式,进一步通过自由能分解法,筛选出蛋白A配基上的热点残基,以及各个残基与Fc片段的相互作用能。在此基础上设计组合型配基FYQ-ABI(苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5氨基苯并咪唑)。通过分子模拟的方法研究配基-蛋白间的相互作用以及结合模式。分子动力学模拟表明,配基在中性条件下能稳定地结合在Fc片段上,疏水相互作用和静电相互作用在结合过程中起到了重要的作用。以琼脂糖为基质制备了FYQ-ABI层析介质,考察介质的静态以及动态吸附分离性能。结果表明FYQ-ABI介质对hIgG表现出较强选择性,从hIgG/BSA混合蛋白溶液中分离hIgG,可以得到纯度超过99%的hIgG。优化配基偶联方法,制备高配基密度的FYQ-ABI介质。介质对hIgG的吸附能力随着配基密度的升高而越高。在pH 7.0的条件下,介质的动态载量可达到20.1 mg/mL介质。FYQ-ABI对hIgG有较高吸附量和较好的耐盐性,并且可以通过添加NaCl的方法来提高介质的选择性。用0.1 M NaOH测定配基稳定性时发现随着处理的时间延长,FYQ-ABI介质对hIgG的吸附量变化较小,但是HSA的吸附量急剧下降,进一步验证后发现FYQ-ABI配基上谷氨酰胺的酰胺基团在一定条件下会发生水解而提高配基的选择性。合成水解后的配基FYE-ABI(苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸-5氨基苯并咪唑),并偶联到琼脂糖基质上进行相关测试。在pH 7.0的条件下该配基具有最大饱和吸附容量91.5 mg/g介质。保留时间为2min的条件下,介质的hIgG动态载量可以达到22.3 mg/mL介质。考察不同洗脱pH对保留因子和洗脱收率的影响,结果表明抗体在pH 4.0～pH 5.0的条件下就能被有效地洗脱下来,可以作为后续分离的洗脱条件。进一步考察介质从HSA/hIgG混合蛋白和人血清中分离hIgG的能力,其中分离人血清的最优洗脱pH为4.5,此时hIgG的纯度和收率分别为93.9%和88.9%。
【图文】：
图１．１抗体分子结构示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ发明了杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体，第一次成逡逑体外合成了单克隆抗体，并于１９８４年获得诺贝尔奖［１气自从单抗出现以来，逡逑用范围在不断拓宽，包括（１）免疫诊断、肿瘤的诊断、多肽激素的检测以逡逑的病毒细菌检测诊断等；（２）细胞表面结构的区别和精细分析；（３）疾病逡逑域应用［１１１。自１９８６年首个获批上市的抗体药物Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ邋０ＫＴ３问世以来，逡逑２０１７年底全球批准上市的单抗药物总计达７３个。单抗药物在自身免疫性疾逡逑菌感染类疾病、癌症等［１２］疾病的治疗中发挥着重要的作用。近年来抗体药逡逑展十分迅速，抗体新药获批呈现井喷趋势。表Ｕ列举了邋２０１７年全球销售逡逑５的抗体药物。面对如此庞大的市场需求，对于抗体药物生产将是一个巨大逡逑
本文研究的是蛋白Ａ和Ｆｃ片段的相互作用。首先从ＰＤＢ蛋白数据库选取分逡逑辨率为２．９Ａ的Ｆｃ片段模型（编号：１ＦＣ１），它由两条相同的链（Ａ链和Ｂ链）构逡逑成如图２．２所示。为减少计算量，对Ａ链进行分子对接和分子动力学模拟。删除逡逑其中的糖基、游离离子和水分子，并从Ｈ＋＋网络计算服务平台获得不同ｐＨ下氨基逡逑酸残基的质子化状态，其中盐浓度设置为２０ｍＭ，邋ｐＨ设定为相应值，其它为默认逡逑参数。采用邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ邋Ｓｔｕｄｉｉｏ邋３．０邋软件包（ＤＳ邋３．０，，邋Ａｃｃｅｌｒｙｓ邋Ｉｎｃ．，Ｓａｎ邋Ｄｉｅｇｏ，邋ＵＳＡ）逡逑构建仿生配基结构，基质部分用f窕硎荆⒉捎茫樱恚幔颍簦停椋睿椋恚椋澹蚰？榻心芰垮义嫌呕ｅ义希＃穑
本文编号：2663608
【图文】：
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本文研究的是蛋白Ａ和Ｆｃ片段的相互作用。首先从ＰＤＢ蛋白数据库选取分逡逑辨率为２．９Ａ的Ｆｃ片段模型（编号：１ＦＣ１），它由两条相同的链（Ａ链和Ｂ链）构逡逑成如图２．２所示。为减少计算量，对Ａ链进行分子对接和分子动力学模拟。删除逡逑其中的糖基、游离离子和水分子，并从Ｈ＋＋网络计算服务平台获得不同ｐＨ下氨基逡逑酸残基的质子化状态，其中盐浓度设置为２０ｍＭ，邋ｐＨ设定为相应值，其它为默认逡逑参数。采用邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ邋Ｓｔｕｄｉｉｏ邋３．０邋软件包（ＤＳ邋３．０，，邋Ａｃｃｅｌｒｙｓ邋Ｉｎｃ．，Ｓａｎ邋Ｄｉｅｇｏ，邋ＵＳＡ）逡逑构建仿生配基结构，基质部分用f窕硎荆⒉捎茫樱恚幔颍簦停椋睿椋恚椋澹蚰？榻心芰垮义嫌呕ｅ义希＃穑
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