利用Caco-2细胞模型评价益生元发酵上清生理功效方法的优化及应用

发布时间：2020-05-15 06:17

【摘要】：益生元多为一种在胃肠道上段不易消化的碳水化合物,它通过对菌群结构的调节来产生有利于人体健康的作用。益生元已被报道具有多种生理功能,例如通便、抗癌、促进矿物质吸收、调节脂质代谢和改善免疫作用的健康功效等。目前体外评估益生元的方式主要有两种1)体外发酵模型;2)体外细胞模型。通过上述两种模型的结合,我们不仅可以观察益生元对发酵菌群结构以代谢产物的调整,而且可以揭示发酵产生的代谢产物的生理功效。然而,在使用细胞模型方面仍存在稍许不足:首先,现有测定方法无法实现对细胞反应的动态监测;其次,关键的实验因素如上样体积和作用时间尚未确定。为了解决上述不足,本研究引进一种新的技术平台——细胞实时功能分析(RTCA SP)系统。该系统的核心是底部整合有微电子传感器的细胞检测板。细胞反应以基于微电极阻抗的细胞指数的形式呈现。它具有实现数据自动采集和实时分析的优势。为了标准化基于RTCA SP系统以Caco-2细胞模型评估益生元时的上样体积以及作用时间,我们设计了如下实验:1)测定3种不同SCFAs混合液对Caco-2细胞生长的影响;2)对低聚果糖(FOS)和抗性淀粉(RS)发酵上清的动态测定。我们发现Caco-2细胞对SCFAs混合液的耐受范围为0-8 mmol/L。据此设定益生元发酵上清的上样体积为6.3%(v/v)。我们也发现益生元发酵上清作用于Caco-2细胞生长模型和肠屏障模型的时间范围分别是0-16h和0-72h。所以在比较FOS和RS的生理功效时我们挑取的数据分别来自16h(Caco-2细胞生长)和72h(Caco-2单细胞层屏障功能)。FOS和RS在两种营养条件下(PBS体系和BCM体系)与新鲜粪便进行厌氧发酵。采用RTCA SP系统以及上述实验参数评估FOS和RS的发酵上清。我们发现FOS和RS均可以刺激Caco-2细胞生长和增强Caco-2单细胞层屏障功能;特别是在PBS体系,FOS和RS(发酵24h和72h)的上清可以显著地促进Caco-2细胞生长。为了验证上述结果的准确性,我们对对响应益生元的关键OTUs丰度以及发酵上清中SCFAs的含量进行分析。结果发现FOS和RS发酵上清的生理功能同益生元富集的SCFAs产生菌Faecalibacterium和Roseburia呈显著正相关;同潜在致病菌Oscillibacter,Bilophila,Escherichia/Shigella和Streptococcus呈显著负相关。FOS和RS发酵上清对Caco-2单细胞层屏障功能的增强作用同乙酸、丙酸、丁酸和总酸的含量呈显著正相关;同异丁酸的含量呈负相关。综上所述,本研究将RTCA SP系统引入到对益生元发酵上清作用效果的评估中,并确定了Caco-2细胞模型在该系统中的评估体系的上样体积和作用时间,在此基础上对FOS和RS发酵上清的生理功效了进行评估。根据FOS和RS发酵上清的生理功效与发酵液的菌群结构的改变及发酵上清中SCFAs含量的关联分析,揭示了FOS和RS通过调整发酵菌群的群落结构而影响其代谢产物,进而刺激Caco-2细胞生长和增强Caco-2单细胞层屏障功能。本研究表明了利用RTCA SP系统对益生元作用功效进行体外评估的可靠性。
【图文】：

主要途径,脂类分解,前体脂肪细胞,结肠炎

图 1-1 . SCFAs 发挥作用的主要途径。Figure1-1 Fermentation of dietary fiber leads to the production of SCFAs via various biochemical pathwahe size of the letters symbolizes the ratio of SCFAs present. In the distal gut, SCFAs can enter the cells throiffusion or SLC5A8-mediated transport and act as an energy source or an HDAC inhibitor. Luminal acetatropionate sensed by GPR41 and GPR43 releases PYY and GLP-1, affecting satiety and intestinal tranuminal butyrate exerts anti-inflammatory effects via GPR109A and HDAC inhibition. Furthermore, propionan be converted into glucose by IGN, leading to satiety and decreased hepatic glucose production. SCFAs lso act on other sites in the gut, like the ENS, where they stimulate motility and secretory activity, or the immells in the lamina propria, where they reduce inflammation and tumorigenesis. Small amounts of SCFAs (mocetate and possibly propionate) reach the circulation and can also directly affect the adipose tissue, brain, ver, inducing overall beneficial metabolic effects. Solid arrows indicate the direct action of each SCFA, ashed arrows from the gut are indirect effects.乙酸是可以到达外周循环的含量最丰富的 SCFAs，最近报道可以跨过血脑屏障被脑从而直接影响饮食控制中枢[15]。它主要是和 GPR43 结合，，在代谢上抑制脂类分解[15加胰岛素敏感性[16]和能量消耗、促进 PYY 和 GLP-1 的分泌、前体脂肪细胞的分化和控制[17,18]；在癌症和 IBD 方面可以防治 IBD、在结肠炎动物模型中减轻炎症和促进肠癌细胞的凋亡；免疫方面

苦瓜,制品,单因素方差分析,字母表示

健康个体 BMP 组和 BME 组丁酸的浓度无显著性差异，但在 2 型糖尿病个体中则恰恰相反(图 1C; 图 1D; 图1E; 图 1H; 图 1I; 图 1J)。图 1 苦瓜制品发酵上清 pH 和 SCFAs 浓度的测定。A-E：健康个体；F-J：2 型糖尿病个体。相同字母表示组内无显著性差异(p>0.05, 单因素方差分析, Tukey 后检验)Figure 1 Determination of pH and SCFAs concentrations in the fermentation supernatant of bitter melon preparations. A -EHealthy individual; F-J T2D patient. Same letter represents no significant difference within the group (p >0.05, One-Way ANOVA，
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1

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