青霉菌秸秆发酵物中酶协同氧化降解木质素机制研究

发布时间：2020-05-15 10:44

【摘要】：秸秆由木质素包裹纤维素和半纤维素构成复杂的结构。开发利用秸秆资源关键是如何降解木质素。降解木质素的方法有多种,其中生物学方法,特别是酶法具有条件温和、时间短、无需占用大量的场地而受到广泛的关注。秸秆降解有多种酶的参与,研究秸秆木质素降解过程中多种酶的协同作用机制,有助于提高秸秆中木质素的降解效率。本试验以一株高产木质素过氧化物酶(LiP)的青霉菌JSU-003,通过单因素及正交试验优化青霉固态发酵合成LiP的培养基组成及培养条件,从发酵液中酶活性与预处理后基质糖化的糖得率回归分析角度以及纯化的酶和发酵液粗酶液对底物的亲和力和最大反应速率角度研究了纤维素酶在LiP催化过氧化氢氧化降解秸秆木质素过程中的协同作用,为秸秆生物降解、以及筛选及诱变高产LiP菌株奠定理论基础。研究得到的主要结论如下:(1)分离获得的菌株JSU-003通过形态学及ITS鉴定为青霉。单因素试验显示青霉固态发酵合成LiP最佳碳源为麦芽糖、甘油,最佳氮源为玉米蛋白粉、硝酸钾、鱼粉蛋白胨,正交试验结果显示菌株JSU-003合成LiP最适培养基为麦芽糖1%,甘油1.5%,鱼粉蛋白胨1.5%,硝酸钾0.5%,玉米蛋白粉1.5%,最佳发酵条件为料浓度50%,培养温度27℃,原料用6%的氢氧化钠预泡28 h,后经过113℃灭菌24 min。在此条件下,发酵第四天LiP酶活达到最大值18.04U/g。(2)以纤维素酶三个组分羧甲基纤维素钠酶、滤纸纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的单独作用和交互作用用主成分分析法(PCA)构建三种酶的综合水解指数(CHI),以糖得率(Y_(trs))作为响应值,LiP、CHI为自变量,用SPSS软件进行回归分析,研究结果显示发酵物中纤维素酶糖化能力与糖得率呈负相关,即秸秆木质素氧化降解过程中,纤维素的糖化抑制木质素的氧化降解。(3)用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析,SephadexS-100凝胶过滤层析等方法分离纯化LiP。经过DEAE-FF离子交换层析后LiP达到了17.9的纯化倍数,64%的酶活回收率和3.6%的蛋白回收率;经过Sephacryl S-100 HR凝胶层析后LiP达到了21.5的纯化倍数,17%的酶活回收率和0.7%的蛋白回收率。SDS-PAGE电泳结果显示一条带,对LiP进行蛋白质谱鉴定及X射线衍射分析,得到蛋白分子量为45.4 kDa,得到的肽序列为lsahsvaavndvdptvqglp。比较发酵液中LiP和纯化的LiP米氏常数和最大反应速率,纯酶对秸秆木质素底物具有较大的亲合力和最大反应速率,进一步证明了纤维素的糖化产物葡萄糖抑制木质素的氧化降解。(4)比较经纯化的LiP以及发酵液中LiP降解木质素动力学参数,纯化的酶μ_(max)(1.15 mg/mL/h)高于发酵液中LiP的μ_(max)(0.86 mg/mL/h),K_m(3.02 mg/mL)小于发酵液中LiP的K_m(4.74 mg/mL),结果证明与发酵液中LiP相比,LiP纯化增加了酶与底物的亲和力,提高了最大反应速率。这个结论也进一步证明发酵液中纤维素酶对LiP催化H_2O_2氧化降解木质素的干扰作用。
【图文】：

显微镜下,菌株,青霉属,单子

式：1000100m4mL1minmL10Lmol10μmol631 ，试验结果以三次的平均值±标准误表析基上培养时，菌落颜色由白色转变成灰如图 2.1 所示，，其形态特征为：菌丝有膨大的顶囊，产生不对称的帚状体，单子链。初步鉴定该菌属于青霉属。

序列,全序列,琼脂糖凝胶电泳,无菌性

图 2.2 ITS 全序列的琼脂糖凝胶电泳图Fig 2.2 agarose gel electrophoresis of ITS sequenceM：DNA mark； 1： ITS 序列扩增结果性比较分析 DNA 序列分析，通过与 GenBank 数据库青于青霉的一种（Penicillium sp.）。独特的生物技术优势，例如较高的发酵生产代谢产物抑制，对无菌性的要求较低，本试，探究 LiP 最佳工艺条件。香族环化合物使之断裂从而降解木质素化合
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925

【参考文献】