近红外水光谱组学用于发酵过程生物量、甘油、甲醇含量的测定

发布时间：2020-05-26 10:44

【摘要】：近年来,生物制药行业的迅猛发展。抗体药物作为生物制药行业的支柱产业越来越受到重视,通过发酵过程生产的抗体药物其质量和产量会受到发酵过程中一些关键参数的影响,因此在生产过程中需要对其进行监测。在巴斯德毕赤酵母发酵过程中,第一阶段中生物量的增长和甘油的消耗对于选择诱导时间至关重要,准确的选择对数生长期,在生产中可以节约更多的能源和时间,有利于得到足够数量的代谢旺盛的酵母细胞。在第二阶段,甲醇作为启动子,合适的浓度举足轻重,甲醇浓度过低会导致细胞溶解、分泌的蛋白难以聚合。反之,甲醇浓度过高则会抑制细胞增长和蛋白表达,因此在生产过程中需要对以上3个参数进行测定和控制。而在参数测定的过程中有两个困难需要克服,一是由于发酵液的复杂性和菌体的扰动,所以光谱的质量需要提高。为此,本研究引入了差谱方法的概念,先前研究已经证明差谱法的优越性,本文对比了减去同一张溶剂法、依次相减法和最小面积法,以便能最大程度提高光谱的质量。二是甘油、甲醇含量比较低,近红外光谱技术属于二级方法,故本研究引入了水光谱组学的概念。水光谱组学可利用扰动要素对水的光谱的影响,实现对其它物质的监控,这已成功应用于监测低浓度的蛋白质、糖等,该技术为准确监测甘油、甲醇含量提供了一种新的可能性。因此,本研究首先利用简单体系考察了差谱法和水光谱组学的可行性,而后将其结合近红外光谱技术引入到巴斯德毕赤酵母发酵过程中生物量、甘油、甲醇的测定过程中,进一步探究近红外光谱技术结合差谱法、水光谱组学在其发酵过程中的可行性。本文具体内容如下:(1)三种不同差谱方法的研究。本章研究中利用Antaris II傅立叶变换近红外光谱仪对三种差谱法(减去同一张溶剂法、依次相减法、最小面积法)在甲醇-水溶液简单体系中的优越性进行了探究,以便能最大程度上提高光谱的质量。首先,配制0.1-2.5%(v/v)的甲醇-水溶液,间隔0.1%,分直接稀释和梯度稀释,一式两份,共100个样品,在实验室条件下进行。借助于偏最小二乘回归(partial least squares regression,PLSR)模型中的回归系数考察了直接稀释法和梯度系数法两种溶液配制方法,结果显示这两种溶液配制方法无显著性差异,对模型的准确度影响不大。在直接稀释基础上考察了上述三种差谱方法,以交叉验证均方根误差(root mean square error of cross validation,RMSECV)值为主要评判标准,结果显示依次相减差谱法建模效果最佳,面积最小法次之,最差的是减去同一张光谱法,但是仍然比传统的3张光谱取平均建模法的RMSECV值低50%左右。(2)水光谱组学用于毕赤酵母发酵过程的可行性研究。本研究考察了近红外光谱技术结合水光谱组学对甲醇-培养基(yeast extract peptone dextrose,YPD、、luria-bertani,LB、yeast extract peptone ethanol glycerin,YEPG)体系中甲醇含量测定的可行性。首先,实验室条件下利用直接稀释法配制甲醇浓度范围在0.1-2.5%(v/v)之间的甲醇-培养基(YPD、LB、YEPG)溶液,间隔0.1%,每种培养基有25个样品。其次,选择12个水基质坐标(water matrix coordinates:WAMACS,7149 cm--1、7082 cm--1、6954 cm-11、6940 cm-11、6900 cm-1、6871 cm--1、6836 cm--1、6773 cm--1、6702 cm--1、6667 cm--1、6509 cm--1、6400 cm-1),通过雷达图反应甲醇的存在对水光谱的影响。结果显示即使甲醇的加入量是0.1%,仍可以对原溶液的吸光度产生影响。然后,利用PLSR建立了水光谱组学用于低含量甲醇测定的回归分析模型。以甲醇-YPD溶液为例,最佳模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv2和Rp2值分别是0.014%,0.03 8%,0.047%,1.000,0.997,0.999。甲醇-LB培养基和甲醇-YEPG培养基得到的结果和上述的结果均类似,结果证明水光谱组学可以用于甲醇含量的测定,为低含量甲醇的测定提供了一个新的思路。(3)毕赤酵母发酵过程关键参数:生物量、甘油、甲醇的测定。本研究将上述得到的结论用于巴斯德毕赤酵母实际发酵过程中关键质量参数:生物量、甘油、甲醇含量的测定。首先在摇瓶水平上分别平行4次试验(第一阶段)、5次试验(第一阶段),从巴斯德毕赤酵母发酵过程的第一阶段和第二阶段分别取100个和110个样品,其中第一阶段的样品包含了生物量和甘油含量的变化,第二阶段的样品包含了甲醇含量的变化。这三者的一级数据分别通过紫外分光光度计、甘油含量测定试剂盒、气相色谱法测得。在建模之前,分别对异常点的剔除、数据集划分和光谱预处理方法进行了优化。最终,生物量最佳的LWR模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv2、Rp2值分别是0.0615、0.105、0.101、0.994、0.982、0.980;甘油的LWR模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv2、Rp2值分别是0.243、1.037、0.765、0.997、0.951、0.963;甲醇的PLSR模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP、Rc2、Rcv.2、Rp2值分别是0.128、0.141、0.149、0.924、0.907、0.852;这三个模型可以实现快速、准确地对巴斯德毕赤酵母发酵过程中生物量、甘油和甲醇的定量检测。本论文的创新点包括:(1)本研究首次选择了12个WAMACS,用于反应甲醇对水光谱的影响,考察了水光谱组学用于发酵过程中的可行性。(2)本研究首次建立了差谱法和水光谱组学用于测定发酵过程中关键质量参数(生物量、甘油、甲醇)的NIR方法。
【图文】：

Ｉ邋．．ｆ逦），邋Ｍ＞邋？0邋；ｆ．邋ｉ？邋．．．逦＇邋．！（逦？＜？＜？．，，，逦ｉ．．逡逑图１－２傅里叶变化型近红外光谱仪原理图逡逑２．２近红外光谱分析技术的优缺点逡逑近红外光谱分析技术之所以能在短短的１０多年内，在众多领域得到了广泛逡逑的运用，进而在数据处理及仪器制造方面有如此迅速的发展，，主要因为它在分析逡逑测定中有其无可复制的优越性［｜１］，见图１－３所示。逡逑（１）可以用于样品的定性．也能够用于样品的定置。定性一般是指逡逑先取得一组己知样品的光谐建立模型，再洌得待定性样品的光谙．用逡逑~k类原理确定该样品是否属于该组样品的一类。如果样品有好几类，逡逑则可建立多个模型．用未知样品的诸图来确定其所属类型。例如．在逡逑辅料鉴别中．区分不同来源的疏酸软骨素（猪和鲨鱼来源）。定量一逡逑般是指采用多元校正方法及一组己知性质或组分的样品所建立的模型。逡逑例如．建立５油

本文编号：2681716