银杏种仁ACE抑制肽的分离纯化、鉴定及抑制机理的研究

发布时间：2020-05-27 04:54

【摘要】：近年来,天然食源性ACE(血管紧张素转换酶)抑制肽由于活性高,吸收好等优点,在食品和医药领域具有潜在的应用前景,越来越受到研究者的关注。本论文以银杏种仁为原料,提取得到银杏蛋白,采用碱性蛋白酶Alcalase酶解得到水解产物,并通过响应面方法优化了制备工艺,再经过纯化鉴定得到银杏种仁ACE抑制活性肽,进一步研究了ACE活性肽对人脐静脉内皮细胞的影响,为银杏种仁ACE抑制肽的研究开发提供了一定的理论依据。主要研究结果如下:1、银杏种仁ACE抑制肽制备的工艺优化。以水解度(DH)和多肽含量为指标,通过单因素试验和响应面优化试验得到了制备银杏ACE抑制肽的最佳酶解工艺,其最佳条件为:酶添加量2400 U、超声波功率118 W,超声时间23 min,超声温度48℃。在此工艺条件下,多肽得率最高,为14.71%。2、三种银杏种仁ACE抑制肽纯化与鉴定。采用超滤技术将银杏蛋白水解物进行粗分离,分为1 kDa、1-3 kDa、3-5 kDa、5-10 kDa以及银杏蛋白总水解物GPHs五个组分,研究了分子量与体外抗氧化活性及ACE抑制活性的关系。此外,使用葡聚糖凝胶层析进一步纯化后,进行LC-MS/MS鉴定,得到了3种可能的ACE抑制肽(TNLDWY、RADFY、RVFDGAV),研究了这三种ACE抑制肽的竞争模式与相互作用。结果表明,分子量小的银杏肽其体外ACE抑制活性较高,鉴定得到的肽RVFDGAV体外ACE抑制活性最强,其IC _(50)值为1.286 mM,表现为竞争性抑制模式,而TNLDWY,RADFY表现为非竞争型抑制模式。分子模拟对接表明,三种ACE抑制肽与ACE结合良好并存在相互作用。由此,Alcalase制备得到的银杏肽具有有效的ACE抑制活性。3、银杏种仁ACE抑制肽的作用机理。以人脐静脉内皮细胞(EA.Hy 926)为模型,研究银杏种仁ACE抑制肽可能的降压机制。通过观察细胞活力与形态,分析细胞内的NO释放量、ET-1分泌量以及ROS水平,并从血压相关基因表达的层次研究抑制肽对细胞的影响。结果表明银杏种仁ACE抑制肽可能通过增加NO释放量,降低ET-1和ROS水平的分泌来达到降压的目的。荧光定量PCR结果显示细胞经ACE抑制肽处理后,RAAS系统中,ACE基因的mRNA水平明显下降,MAPK1、MAPK3、MAPK14基因的mRNA水平明显上升,血管功能中NOSTRIN、NF-κB基因的mRNA水平明显下降,ECE1、eNOS、JAM1、GUCY1A1、GUCY1B1基因的mRNA水平明显上升。
【图文】：

结果如下图。由图 2.1 可知，在酶添加量为 2500 U 之前解度和多肽含量逐渐增加，当酶量达到 2500 U 时，水解度之后，继续增加酶量对银杏蛋白的酶解影响略有降低。由此 时，效果最好。综上所述，选择 2000 U、2500 U、3000的三个水平。

图 2.2 超声波功率对酶解银杏蛋白的影响Fig 2.2 Effect of ultrasonic power on enzymatic hydrolysis of ginkgo p声波时间对酶解银杏蛋白的影响加量 2500 U、超声功率 120 W、超声温度 50 ℃ 和底物浓别为 15min、20min、25min、30min 和 35min，对银杏蛋白2.3 可知，在时间到达 25 min 之前，随着时间的增加，水解当时间达到 25min 时，水解度和多肽含量达到峰值，效果最间，水解度和多肽含量呈现出逐步下降的趋势，分析为 25间的增大，碱性蛋白酶的活性逐渐下降，，效果逐渐变差。综、25 min 和 30 min 作为后期响应面实验的三个水平。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ464

【参考文献】

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本文编号：2682985