基于小分子连接DNA末端保护结合银纳米簇和金纳米粒子的蛋白质分析

发布时间：2020-05-27 07:41

【摘要】：蛋白质是人体细胞、组织、器官的重要组成成分,是一切生命的物质基础。蛋白质与人体的各种生理活动,如维持肌体正常的新陈代谢、保障各类物质在体内的正常输送、保证各种免疫活动的正常进行等,有着密切的关系。研究表明,人类的某些疾病的发生与蛋白质的异常表达也密切相关。因此开发灵敏、简单、快速的蛋白质检测方法对蛋白质性质、功能的深入研究以及相关疾病的临床诊断,药物研究等都具有非常重要的意义。小分子连接DNA末端保护是利用DNA链上标记的小分子与蛋白质特异性结合,能够有效阻止外切酶对DNA链的降解的作用。在末端保护中DNA序列无编码限制,DNA末端易于标记,而且不影响DNA序列和标记分子的活性,易与DNA扩增手段结合,这些优势为蛋白质的检测提供了新的思路。因此,近年来基于小分子连接DNA末端的保护原理检测蛋白质的方法受到人们的广泛关注。本论文基于小分子连接DNA末端的保护原理分别结合两种金属纳米材料-银纳米簇和金纳米粒子,构建了两种检测蛋白质的新方法,主要内容如下:一、基于小分子连接DNA末端保护结合银纳米簇(AgNCs)荧光检测蛋白质。首先设计了一条3'端标记小分子生物素(biotin)的单链DNA探针,当没有靶蛋白-链霉亲和素(STV)时,biotin标记的DNA探针被Exo I从3'端降解。加入具有强荧光的AgNCs,AgNCs本身的荧光不会受到影响;当STV存在时,STV与biotin特异性结合,保护DNA探针不被Exo I降解。DNA探针与加入的AgNCs 3'端裸露出的序列杂交,能够猝灭AgNCs的荧光。荧光信号降低的程度与靶蛋白质STV的量具有一定的定量关系。实验结果表明,在2~40 pmol范围内,荧光信号与STV的量具有良好的线性关系,检出限为1.82 pmol STV。该方法简单、成本低廉,特异性良好,但方法灵敏度有待于进一步改善。二、基于小分子连接DNA末端保护结合金纳米粒子(AuNPs)可视化检测蛋白质。我们设计了一条3'端标记biotin的单链DNA探针,当目标蛋白STV不存在时,加入Exo I后DNA探针被降解,AuNPs没有单链DNA探针保护,在一定的盐离子浓度下发生聚集,溶液呈蓝色;当靶蛋白STV存在时,STV与DNA探针上的biotin特异性结合,从而保护DNA探针不会被Exo I降解。带负电的DNA单链探针通过静电结合吸附在AuNPs的表面,阻止了盐离子引起的AuNPs的聚集。分散的AuNPs溶液呈红色。通过AuNPs溶液聚沉前后溶液颜色以及吸光度的变化对目标蛋白质进行定量分析。吸光度比值A_(550 nm)/A_(700 nm)与STV的量在2~20 pmol的范围内呈良好的线性关系,STV的检出限为1.40 pmol。该方法不需要贵重的仪器设备,利用裸眼观察即可得到检测结果,更加便捷。
【图文】：

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是基于抗原和抗体的特异性识别而建立的一种检测法[10-11]。根据反应中是否标有示踪物，免疫分析法标记免疫分析。非标记免疫分析法是通过将待测抗原发生特异性吸附反应，可直接产生光信号或者电放射性核素、荧光素、铁蛋白、酶、化学发光剂等上制成示踪物质，与相应的抗原或者抗体反应。通仪等仪器对抗原或抗体进行定性或定量测定。标记分析方法，所以标记免疫分析方法在蛋白质的应用免疫分析法。体相互作用的放射免疫分析法法 (Radioimmunoassay，RIA) 是 Yalow 和 Berson[标记抗原或抗体的免疫学检测方法。基本原理如图与未标记的抗原与一定量的特异性抗体产生特异性

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故这两者存在一定的函数关系，所以可以测定出待测抗原分析法的灵敏度高、简便、通用，被广泛应用到生物学和医、药物等[13-15]。然而一些不可避免的缺点，如实验重复性差反应、假阳性反应，放射性物质对污染环境，对人身体有害法的应用[16]。原抗体相互作用的酶联免疫吸附分析法吸附反应 (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，ELISA的。其原理如图 1-2 所示：首先将酶作为标记物通过共价键，，加入待测样品后，待测样品和酶标记的抗原或抗体与吸附发生特异性结合，形成固相抗原 (抗体) -待测抗体 (抗原明治”结构。这种结构遇到酶的反应底物后会被酶催化产生颜光反应等。之后，研究人员基于 ELISA 结合荧光、化学发立了各种蛋白质分析方法[18-20]。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ937

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