菊糖蔗糖酶的性质鉴定及分子改造研究

发布时间：2020-05-30 22:55

【摘要】：自然界中存在两种果聚糖,按照糖苷键型的差异可分为菊糖和levan型果聚糖。菊糖在一些菊科植物中含量丰富,具有许多优异的性质和生理功能,已被作为可溶性膳食纤维,应用于食品、医药等许多领域。目前,工业化的菊糖大多来自植物菊苣,相反,levan型果聚糖主要来自微生物,植物中含量很少。国内尚没有关于微生物来源菊糖的报道,实际上,一些微生物可通过菊糖蔗糖酶(Inulosucrase,EC:2.1.4.9)以蔗糖为唯一底物,一步合成菊糖。众所周知,多糖的分子量是影响其性质和功能的关键因素,而微生物菊糖与植物菊糖的主要不同在于分子量,微生物菊糖的分子量一般在10~6 g/mol以上,是植物菊糖的百倍。即使如此,微生物菊糖及菊糖蔗糖酶仍未得到足够的重视。本课题鉴定了一种来源于乳酸菌L.gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶,并对酶学性质和产物多糖的键型进行鉴定。之后,对菊糖合成条件进行优化。最后,通过定点突变获得了使酶活和稳定性提高的正突变。本课题利用不同的N-端截断方式构建重组菊糖蔗糖酶。相应的截断基因插入进载体pET-22b(+)中,构建重组质粒。重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)内,IPTG诱导重组酶的过量表达。通过检测两种截断的菊糖蔗糖酶在最适pH和温度下的活力表明:不同的N-端截断方式仅改变了菊糖蔗糖酶的最适pH和温度,对酶活的影响不大。酶学性质鉴定表明,Laga-ISase(截断信号肽、N-端的101个氨基酸和C-端)总酶活的最适pH和最适温度分别为pH 5.5和35℃。大部分二价金属离子对Laga-ISase酶活有促进作用,其中Mn~(2+)可以将酶活提高至157%。热稳定性研究表明,45℃保温3 h,残余酶活仍保持为原始酶活的84%,为目前已经鉴定的菊糖蔗糖酶中热稳定性最高的。结构稳定性研究表明,Laga-ISase的变性温度为55℃。对Laga-ISase的反应动力学研究表明,该酶的总酶活和转糖苷酶活的反应动力学行为不遵循米氏方程。而水解酶活符合米氏方程底物饱和的典型特点,且水解酶活的K_m为44.12 mmol/L。通过傅里叶变换红外光谱和核磁共振检测产物多糖的糖苷键型,确定产物为β-(2,1)糖苷键连接的菊糖。以30%蔗糖为底物,对酶法合成菊糖的条件进行优化,获得菊糖合成的最适加酶量和时间分别为:4.5 U/g蔗糖和1.5 h。在最适条件下,获得的菊糖的分子量为5.86′10~6 g/mol。之后,通过分子生物学手段结合计算模拟和理性设计,获得13个定点突变的突变体。通过对突变体酶的活力和结构稳定性进行研究,发现了对酶活和结构稳定性起重要作用的关键位点。其中,Q196E的总酶活和T_m值分别降低至野生酶的37.8%和54.2℃,这表明残基Gln196对酶的活力和结构稳定性具有重要作用。另外,获得了使酶活提高的正突变,突变体D288E的酶活为野生酶的131.5%。大部分突变体的T_m值增加,其中A310E、S346A、I478M和A491S的T_m值分别较野生酶提高了1.38、1.39、1.83和1.31℃。
【图文】：

分子结构图,菊糖,果聚糖,分子结构

果聚糖是以果糖分子为基本组成单元，在非还原性末端有一分子葡萄糖的多糖。自然界中主要存在两种果聚糖，分别是菊糖和levan类型果聚糖。两者的主要差别体现在连接果糖基的糖苷键的不同。菊糖的果糖基分子间通过β-(2, 1)糖苷键连接（图1-1A），而levan类型果聚糖则是通过β-(2, 6)糖苷键（图1-1B）。菊糖在自然界中相对广泛的存在于许多植物中，而levan类型果聚糖的植物来源仅限于少许草本植物中且含量极低，如：冰草和鸭茅等。很多微生物含有一种能将蔗糖转化成levan类型果聚糖的果聚糖蔗糖酶，因此，对于levan类型果聚糖的研究主要是针对微生物来源的levan类型果聚糖。鉴于菊糖较广泛的植物来源，对于菊糖的研究比levan类型果聚糖更加深入。图 1-1（A）菊糖分子结构（B）levan类型果聚糖分子结构Fig. 1-1 (A) The molecular structure of inulin (B) The molecular structure of levan-type fructan1.2 菊糖概述1.2.1 菊糖的分类及植物来源菊糖类型的果聚糖按照聚合度可分为低聚果糖（聚合度为2-10）和菊糖（聚合度大于10）[1]。本文将β-(2, 1)糖苷键连接的低聚果糖和菊糖统称为菊糖。自然界中，菊糖存在于许多植物中

菊糖,蔗糖酶,歧化反应,反应过程

菊糖蔗糖酶有三种主要功能。其一，剪切蔗糖；其二，将果糖基转移到另一分子蔗糖上；其三，延伸菊糖链。因此，当菊糖蔗糖酶利用蔗糖为唯一底物时，会发生三种连续的反应，如图1-2A。首先，在菊糖蔗糖酶的作用下蔗糖被分解为一分子葡萄糖和酶-果糖基复合体中间物。其次，如果水作为果糖基受体，果糖基会从酶上释放，发生水解反应。相反，，如果另一分子蔗糖作为果糖基受体，会发生转糖基反应，生成蔗果三糖。最后，不断延伸的低聚果糖分子不断作为受体，发生聚合反应，菊糖分子不断延伸。Ozimek等发现，L.reuteri121菊糖蔗糖酶也具有歧化反应的能力[38]（如图1-2B）。因此，对应于菊糖蔗糖酶的催化进程，定义了三种酶活。反应体系里葡萄糖的量与供体蔗糖一致，代表总酶活。果糖的量与参与水解反应的蔗糖的量一致
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ929

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