可抑制α-淀粉酶的卵黄抗体的制备及其口服靶向给药的研究

发布时间：2020-05-30 23:12

【摘要】：卵黄抗体(IgY)具有成本低、特异性强、稳定性好、口服安全等优点,利用其制备新型α-淀粉酶抑制剂(α-AI)具有巨大的应用潜力。目前利用纳米Fe_3O_4靶向治疗肿瘤的研究十分广泛,但在糖尿病靶向治疗中研究甚少,将IgY偶联于磁性Fe_3O_4纳米颗粒构建具有靶向功能的IgY纳米探针,可提高IgY的有效利用率。IgY属于蛋白质,口服给药时易受胃液降解,海藻酸钙/壳聚糖凝胶具有低毒性、稳定性和生物相容性,可对IgY纳米探针进行包埋,使其顺利到达肠道并发挥降血糖作用。首先,以猪胰α-淀粉酶为抗原免疫蛋鸡,采用水稀释法和硫酸铵两步沉淀法提取纯化可抑制α-淀粉酶的卵黄抗体(A-IgY)。电泳结果显示,A-IgY的重链和轻链的相对分子质量分别为65 kDa和25 kDa,糖基化修饰主要发生在重链部分。A-IgY的纯度为92%,IgY浓度为8.51 mg/mL,提取率为18.5 mg/mL卵黄液。其次,采用Bernfeld法检测A-IgY对α-淀粉酶的抑制效果。结果显示:A-IgY对α-淀粉酶的抑制率自首次免疫后逐渐增加,于第10周达到最大值(98.90%),随后基本稳定至第17周,而N-IgY表现出很低的抑制活性(抑制率约7%)。A-IgY通过非竞争性方式抑制猪胰α-淀粉酶,IC_(50)值为1.189 mg/mL,对相同酶活力的人胰α-淀粉酶的抑制率为82.76%。A-IgY能有效抑制日常饮食中淀粉的分解作用(α-淀粉酶抑制率都在85%以上),与α-淀粉酶的共浴时间的增加能提高A-IgY的抑制活性,共浴90 min时抑制率接近100%。A-IgY对α-淀粉酶的抑制活性在30~40~oC和pH 6~9时最高,在模拟胃液中明显降低,但在模拟肠液中较为稳定。然后,将A-IgY分别偶联于磁性Fe_3O_4@DMSA和Fe_3O_4@PEG纳米颗粒上构建A-IgY纳米探针。表征结果显示:这四种纳米颗粒的形貌良好,尺寸均匀,单分散性好;偶联反应后Fe_3O_4@DMSA和Fe_3O_4@PEG纳米颗粒的水动力尺寸均增加(分别由18.21nm和24.36 nm增加至51.39 nm和54.50 nm),Zeta电位均下降(分别由-36.4 mV和-25.2mV下降至-23.4 mV和-16.1 mV),偶联反应后FT-IR图上显示出酰胺带和IgY的特征吸收峰,这些结果表明A-IgY已经成功偶联至Fe_3O_4纳米颗粒上,且A-IgY装载率分别为68.10%和80.65%。VSM结果显示Fe_3O_4@DMSA@IgY和Fe_3O_4@PEG@IgY纳米颗粒均具有超顺磁性,饱和磁化强度分别为54.08 emu/g和64.05 emu/g,两者的对α-淀粉酶的抑制率分别为83.73%和87.35%,这表明偶联反应并未影响A-IgY的抑制活性。最后,采用海藻酸钙/壳聚糖凝胶为载体包埋Fe_3O_4@PEG@IgY纳米颗粒。结果显示:载Fe_3O_4@PEG@IgY凝胶珠为光滑球体,分散性好,粒度均匀,呈双层膜结构,磁响应性良好,经模拟胃液反应2 h后变得更紧实,A-IgY释放率仅为6.60%,再经肠液反应后能快速释放出A-IgY(2 h释放90.86%)。将凝胶珠靶向给药于健康大鼠后进行CT成像,结果显示凝胶珠在2 h内进入肠道,48 h左右排除干净。将凝胶珠灌胃于db/db大鼠后进行餐后血糖的测试,结果表明载Fe_3O_4@PEG@IgY凝胶珠的降血糖效果明显优于阿卡波糖,且药效持久性更佳,有望成为新型安全的糖尿病防治药物。
【图文】：

IgY和IgG的结构

凝胶珠,靶向,大鼠,灌胃

图 2-1 载 Fe3O4@PEG@IgY 凝胶珠的靶向定位 2-1 Targeted positioning of Fe3O4@PEG@IgY ge常饲养 1 周后禁食 12 h，，灌胃载 Fe固体永磁铁（如图 2-1）进行粒聚集于靶向组织。24、48、72 h 时对大鼠分别进行胃影具体操作为：用灌胃针向大鼠胃），让大鼠自由活动片刻，以使造鼠后，对大鼠的胃部和肠道进行 M察 Fe3O4@PEG@IgY 纳米颗粒在大作为对照。鼠正常饲养 20 天后，随机分成 3 大鼠禁食 12 h（期间自由饮水）后
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ460.6

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