腺苷发酵高产菌株的选育及其工艺优化

发布时间：2020-06-05 14:59

【摘要】：腺苷是一种具有重要生理生化作用的内源性嘌呤类核苷,其主要合成方法有化学合成法和生物合成法。在生物合成法中,微生物发酵法因具有成本低、副产物少、对环境无毒无害等特点,已成为了当今社会腺苷生产的主要方式。目前腺苷的市场需求量比较大,但腺苷产量有限,因此如何快速提高腺苷的产量具有很大的研究意义。本论文首先对产腺苷菌株枯草芽孢杆菌BS-0的发酵性能进行了初步研究,然后通过理化因子诱变并结合微孔板发酵初筛、摇瓶复筛,选育出高产且稳定遗传的腺苷生产菌株。再通过单因素、PB实验、最陡爬坡实验和BB实验系统性优化摇瓶生产工艺,提高腺苷产量。最后通过3L发酵罐放大,优化了腺苷发酵工艺。主要研究内容和结果如下:(1)出发菌株BS-0发酵性能的初步研究在出发菌株BS-0的腺苷合成能力分析基础上,对其生长曲线和发酵曲线进行测定,并利用紫外-可见分光光度计法对腺苷标准曲线进行测定,明确了腺苷的标准曲线表达式为Y=0.0063X,其相关性系数R2约为0.9993。对发酵中的摇瓶接种量、摇床转速、摇瓶装液量和纱布层数进行优化,确定了最佳接种量为6%,250 mL摇瓶装液量为30 mL,转速240 r/min,4层纱布层数,发酵72 h时腺苷产量达18.072 g/L。(2)腺苷高产菌株的高通量诱变选育对出发菌株枯草芽孢杆菌BS-0进行常压室温等离子体(ARTP)、UV-LiCL、硫酸二乙酯(DES)和5-溴尿嘧啶(5-BU)诱变处理后,涂布于含结构类似物6-巯基嘌呤(6-MP)的培养基中,获得抗性正突变株,然后通过24微孔板发酵初筛、250 mL摇瓶发酵复筛,选育腺苷高产菌株。以BS-0为出发菌株进行ARTP诱变,筛选到菌株A-2-12腺苷产量达19.654 g/L,较出发菌株BS-0产量提高了6.78%。实验中建立了24微孔板(装液量为0.96 mL)和250 mL摇瓶(装液量为30 mL)发酵腺苷产量的的一致性,相关性系数R2=0.8996,说明两者具有比较好的一致性,可以采用24微孔板代替传统的摇瓶发酵。快速从大量的突变株中筛选出高产突变株,提高筛选效率。在此基础上采用UV-LiCL诱变处理菌株A-2-12,微孔板发酵初筛、摇瓶复筛,得到菌株Z-30,腺苷产量为19.654 g/L,比菌株BS-0产量提高了8.75%。使用烷化剂DES处理菌株Z-30,获得菌株D-21,产苷量达20.895 g/L,比菌株BS-0产量提高了 15.62%。采用碱基类似物5-BU处理菌株D-21,筛选到菌株5-36,其腺苷产量高达22.817g/L,较菌株BS-0产量提高了26.26%。对高产菌株D-21、5-3、5-5、5-6、5-36进行传代培养,发现传代4次后各菌株产苷能力均有所下降,其中菌株5-36的稳定性较好,腺苷产量为22.432 g/L,比出发菌株BS-0产量提高24.13%。(3)高产菌株5-36摇瓶发酵工艺的优化对最终获得的高产菌株5-36进行摇瓶发酵工艺优化,确定了花生饼粉、装液量、次黄嘌呤、发酵时间、pH最适水平分别为2.0%、25 mL、0.12%、72 h、6.75,显著因子为葡萄糖、玉米浆和CTAB。根据显著因子设计最陡爬坡试验确定了响应面的中心点,响应面实验模拟出的葡萄糖、玉米浆、CTAB的最佳浓度分别为13.874%、2.625%和0.056%,此时腺苷产量达23.794 g/L,经验证,腺苷产量为23.789 g/L,较优化前提高了6.05%,较菌株BS-0产量提高了31.63%。(4)高产菌株5-36的放大发酵优化对腺苷高产菌株5-36进行3 L发酵罐放大培养,检测菌浓、还原糖含量、氨基氮、pH以及腺苷产量,未调控时腺苷产量为16.440 g/L。通过优化接种量,确定了最佳接种量为4%,腺苷产量为19.539 g/L,较优化前提高了 18.85%。随后对葡萄糖的补加进行了研究,结果表明腺苷发酵32 h时补加8%葡萄糖,发酵56 h后腺苷产量达23.449 g/L,较补料前提高了20.01%,较未调控前提高了42.63%。本论文首先对出发菌株BS-0发酵工艺进行初步摸索,为后续研究内容的开展提供了实验基础。实验中诱变后的菌体经结构类似物6-MP抗性平板分选后,通过建立微孔板和摇瓶的缩微一致性和高通量发酵,提高了筛选效率,也节省了原料。通过单因素、PB实验、最陡爬坡实验和BB实验由点到面,系统的优化了腺苷的生产工艺,提高了腺苷产量。实验中通过3L发酵罐调控接种量、补加葡萄糖,腺苷产量较未调控前有明显提高。研究结果对于腺苷的生产具有重要的理论与参考价值。
【图文】：

流程图,技术路线,流程,腺苷

逑ＧＲ逡逑图１－２枯草芽孢杆菌利用葡萄糖作碳源合成腺苷全合成途径逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｏｔａｌ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｂａｃｉｌｌｕｓ邋ｓｕｂｔｉｌｉｓ邋ｕｓｉｎｇ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ａｓ邋ｃａｒｂｏｎ邋ｓｏｕｒｃｅ逡逑可以降低腺苷酸脱氨酶活性防止产物腺苷的分解也可以增强５＇－核苷酸酶的活性［４３３。也逡逑可以选育抗腺苷结构类似物的菌株如抗６－疏基嘌呤（６－ＭＰ）的菌株。此外，改变细胞膜的逡逑通透性，使胞内腺苷不断向胞外分泌。消除腺苷（酸）对琥珀酸腺苷酸合成酶的反馈抑制逡逑也是一个不错的选择。逡逑目前腺苷产生菌菌株大多是经过化学或者物理诱变所得，再用一般的诱变剂和单一逡逑诱变剂处理时很难再筛选出更高产量的菌株，所以今后研究者可以考虑使用新的诱变手逡逑段，提高诱变效率［４２］。逡逑１．５研究内容和技术路线逡逑１．５．１研究内容逡逑腺苷是一种具有重要生理生化作用的内源性核苷，发酵法产腺苷具有明显的优势逡逑［４４，４５］。本文通过对腺苷产生菌的黄嘌呤缺陷型的枯

标准曲线,长扫描,全波,种子液

图２－２腺苷标准曲线逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ａｄｅｎｏｓｉｎｅ逡逑的测定逡逑变和发酵均需要代谢旺盛的种子液，一般对数生长中期知，菌体适应期较长，１４邋ｈ至１８邋ｈ菌体快速增多，３０邋ｈ诱变取用１４至１８邋ｈ的种子液最佳，此时菌体生长快，，１１逡逑
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.6

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