氧化亚铁硫杆菌发酵条件优化及其磁小体与阿霉素的偶联表征

发布时间：2020-06-11 02:11

【摘要】：随着纳米技术和高分子材料的发展,靶向给药用于肿瘤治疗已经成为研究焦点,它可定向到达靶向部位,克服癌症化疗这一难题。在众多的靶向药物载体中,纳米级Fe_3O_4粒子由于容易制备、价格便宜而成为现代科学领域的研究热点。磁小体(magnetosomes,MS)是由趋磁细菌合成的、呈现生物核壳结构的天然纳米磁性颗粒,其主要成分为Fe_3O_4。磁小体作为靶向纳米药物载体有着分布范围窄,具有稳定晶型等优点,并且在一定程度上能克服通过化学或物理方法获得的磁性纳米颗粒存在的纯度不高、粒径不均、容易聚集、生物相容性差,以及必须进行表面修饰才可用于载药等缺陷,同时也可以避免磁性纳米颗粒应用于靶向给药时所存在的低载药量、易团聚、尺寸形貌难以控制等问题。尽管磁小体在生物医学、生物材料等领域有巨大的应用价值。但是,用于载药的磁小体大多分离自Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1和Magnetospirillum magneticum AMB-1,这两种趋磁细菌的培养条件极为苛刻,磁小体产量较低,难以在工业化水平生产磁小体等缺陷极大的限制了磁小体的应用。研究表明,氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,At.ferrooxidans)也可以合成磁小体且其培养条件简单,从中提取磁小体的方法也相对容易,为磁小体的工业化发展提供可能。本研究在实验室前期单因素研究基础上,采用实验室现有的At.ferrooxidans,利用气升式反应器对其进行大规模培养,通过响应面试验,考察发酵条件对磁小体产量的影响,以温度、通氧量、葡萄糖酸浓度为响应变量,以磁小体得率为响应值,最终确定At.ferrooxidans产磁小体的最佳条件,当温度为24℃,通氧量为1.1 vvm,葡萄糖酸浓度为12mmol时,磁小体产量可达到0.398 mg/L。采用京尼平交联剂将抗肿瘤药物阿霉素与At.ferrooxidans磁小体偶联,采用单因素试验,探究偶联温度、偶联时间、京尼平浓度、磁小体浓度以及阿霉素浓度对偶联复合物偶联药物的影响。方差分析表明偶联时间、阿霉素浓度及京尼平浓度对偶联复合物影响显著,基于此利用响应面试验,制定试验方案,以偶联时间、京尼平浓度和阿霉素浓度为响应变量,以载药量、包封率和满意度函数为响应值,得到At.ferrooxidans磁小体与阿霉素偶联的最优方案,当偶联时间为68 h,京尼平浓度为2.4 mg/mL,阿霉素浓度为0.9 mg/mL时,载药量和包封率分别达到最佳值为41.3%和91.1%。本研究通过红外官能团的分析及粒径电位的对比、透射电镜对其形态的观察,可确定偶联复合物偶联的成功,后又对其释药性进行探究。结果表明,通过透射电镜可知,与阿霉素偶联后的磁小体被粘稠模糊的材料包围,并结合粒径电位,与单独的磁小体相比(51.94±5.6 nm),偶联复合物平均粒径增加到83.98±7.5 nm,磁小体和偶联后的阿霉素磁小体复合物的电位分别为-25.85±2.01 mv和-34.42±6.13 mv。通过红外光谱分析可知,磁小体阿霉素偶联复合物既和磁小体有相同的羰基、羟基的官能团,又在470 cm~(-1)处和阿霉素有相同的峰值,更证明了偶联的成功。通过阿霉素偶联磁小体复合物的释药实验,可得出At.ferrooxidans磁小体与阿霉素偶联的复合物在0-38 h时释药速度快,38 h后释药趋于缓慢,最后药物累计释放率近48%,证明了偶联复合物的稳定性和可释药性。通过对药物浓度-时间半对数曲线绘制,可判断该模型属于二室模型,将其与零级动力学、一级动力学以及Higuchi方程进行拟合,结果表明Higuchi方程的拟合相关性(R~2)优于零级释放动力学方程和一级释放动力学方程,说明Higuchi方程更接近实验值,能更好地描述阿霉素磁小体复合物在人工模拟胃肠液中的累积释放量与时间的关系。
【图文】：

平面图,气升式反应器,平面图,滤纸

图 2-1 气升式反应器平面图Figure 2-1Airlift reactor plan产磁小体的条件优化培养及收集种于上述培养基中，接种量 10%，置于0.45 vvm、0.90 vvm、1.35 vvm），温度（10 mmol/L、12 mmol/L），，探究对 At. fer期时，先用普通滤纸进行抽滤，取滤液用滤液。取 pH 为 2.0 的硫酸将滤纸上的菌上清液于新的 EP 管中，离心 8000 rpm，

通氧,磁小体,葡萄糖酸,浓度

温度与通氧量的响应曲面近似椭互作用相对于其他因素相对较强，而温度和葡高线图则显示其交互作用并不明显。通过响应最佳条件为：温度 24℃，通氧量 1.1 vvm，葡所得结果与模型结果非常接近，证实所得模型Design-Expert?SoftwareFactorCoding:Actual磁小体得率(mg/L)DesignPoints0.42670.2012X1=A:温度X2=B:通氧量ActualFactorC:葡萄糖酸浓度=10Design-Expert?SoftwareFactorCoding:Actual磁小体得率(mg/L)DesignPoints0.42670.2012ac
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ460.1;TQ920.6

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