新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）的标记与抑制研究

发布时间：2020-06-19 19:53

【摘要】：β-内酰胺类抗生素(包括青霉素、头孢、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类等)是目前临床上使用最为广泛的一类抗生素。然而,抗生素的滥用和监管缺失加剧了细菌耐药性的产生,抗生素耐药已经严重威胁到人类的生命健康。金属β-内酰胺酶(Metallo-β-lactamases,MβLs)是细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要因素。近年来,携带新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)的超级细菌在全球的传播引发了一场严重的生物医学危机,携带这种酶的细菌几乎可以水解所有的β-内酰胺类抗生素。由于它编码的质粒基因可以水平地在不同细菌之间传递和其水解底物的广谱性,使得对于它的监测和抑制成为临床上很大的挑战。因此,对于NDM-1的监测、标记和抑制研究对人类健康具有极其重要的学术和应用价值。基于这一思路,本文进行了以下两个方面的工作研究:1.基于NDM-1活性位点结构中的半胱氨酸(Cys),发展合成了18个NDM-1的共价抑制剂 1,2-苯并异噻唑-3-酮类衍生物(Ebsulfurs),通过~1H和~(13)C NMR及HRMS对其结构进行了表征。酶动力学研究发现,合成的Ebsulfurs化合物(除1a-b和1f)均对NDM-1展现出良好的抑制活性,IC_(50)值范围为0.16 9μM,且是一种浓度和时间依赖性抑制剂。同时,Ebsulfurs能协同抗生素提高其抗菌活性,其中,1g、1i和1n在浓度为16μg/mL时,使得头孢唑啉对产NDM-1的大肠杆菌的抗菌活性提高了256倍。平衡透析研究表明,Ebsulfurs使得NDM-1中一个Zn(II)的活性中心解体,并释放出了一个Zn(II)。将荧光分子罗丹明B引入到Ebsulfurs,成功构建了一个荧光抑制剂Ebs-R,通过SDS-PAGE和荧光共聚焦显微镜在体外和体内对NDM-1进行了标记和可视化研究,进一步证实了Ebsulfurs和靶蛋白的共价结合。对活菌体内NDM-1的实时活性监测表明,1g对大肠杆菌BL21细胞的IC_(50)值为35.1μM。此外,Ebsulfurs也能有效的提高头孢唑林对产NDM-1临床菌E.coli EC08的抗菌活性。Ebsulfurs对L929小鼠成纤维细胞的细胞毒性评价结果表明,这类化合物毒性较低,可以进一步发展为临床潜在的MβLs抑制剂。2.以MβLs水解头孢类抗生素的机理为理论依据,建立了一种基于苯硫酚探针和苯硫酚化的头孢底物组合的策略检测MβLs和直接针对耐药菌筛选其抑制剂的方法。成功构建了一个苯硫酚化的头孢底物Ce-s和两个苯硫酚探针F-1和F-2。对8种巯基化合物的选择性识别表明,探针F-2对苯硫酚类化合物展示了高度的选择性和灵敏性。F-2监测NDM-1水解底物Ce-s的实验发现,荧光探针检测底物被酶水解是一个时间依赖和底物浓度依赖的过程。对7个文献报导的NDM-1抑制剂在耐药菌体内和体外的抑制和筛选结果表明,这种方法可以用作评价和筛选MβLs抑制剂。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;TQ460.1
【图文】：

细菌,抗生素,机制,耐药

任何生物都有面临外界生存压力下，为使自己免于被伤害淘汰的进化机制。在与抗菌药物的长期斗争中，细菌进化出了一套保护自己不被抗生素灭活的机制，即细菌耐药。全球每年因细菌耐药死亡的人数高达 70 多万，预计到 2050 年全球每年将有 1000 万人死于细菌耐药，耐药问题严重的危险着人类的生命和财产安全。抗生素耐药的机制概括起来主要有以下四个方面[33-35]（图 1-2）：a) 细菌产生灭活酶：细菌通过产生灭活酶使抗生素失去活性，其中细菌分泌 β内酰胺酶水解 β-内酰胺类抗生素是其耐药的主要原因。b) 细菌改变抗生素作用靶点：细菌通过改变抗生素与之作用的靶点位置，使药物分子不能再与之相应的靶点作用，进而无法发挥抗菌活性。c) 细菌改变其外膜的通透性：细菌通过修饰自己的细胞壁或细胞膜降低了自身外膜的通透性，减少了药物分子的摄入量，从而产生对抗生素的耐药。d) 细菌的药物外排机制：长期面对抗生素的压力，细菌主动进化形成一种药物外排机制，通过外排系统将进入体内的抗生素排出体外。

晶体结构,细菌,耐药菌,表型检测

图 1-6 NDM-1 的晶体结构（A）及活性位点（B）.3 金属 β-内酰胺酶的检测由于携带 MβLs 细菌的快速传播和蔓延，因此 MβLs 的检测具有十分重要的意何快速，便捷，灵敏检测 MβLs 以及携带有 MβLs 的细菌已经成为临床研究的热点前，在临床上检测 MβLs 有三种方法：表型检测法：表型检测法是指通过测定细菌对药物的敏感性来判断一种细菌是耐药细菌，这种方法一般包括抑菌圈法、最小抑菌浓度（MIC）法、双纸片协同。美国临床与实验室标准研究所（CLSI）根据这种方法已经制定了一套标准的临床检测细菌药敏性的方法，根据细菌对抗生素的敏感程度，判断其是否耐药。医院检测耐药菌多用此法，这种方法也为治疗耐药菌的感染提供了很大的帮助。药敏性实验一般需要 24-48 h，耗时长，灵敏度和选择性差，无法提供更多的细息，只是判断一种细菌是否为耐药菌的表观方法[51,52]。

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