蜂粮中微生物的分离鉴定及响应面法优化液态发酵条件

发布时间：2020-06-22 14:34

【摘要】：蜂粮是是蜜蜂在蜂巢中将采集到的花粉团咬碎后用蜂蜡封藏,在微生物的作用下,经过一定时间的发酵形成蜂粮。本研究以天然蜂粮作为参考,分离并研究蜂粮中蜂花粉发酵含有的微生物,筛选获得优良发酵性能的菌株,并采用液态小型发酵罐进行发酵实验。最后对人工蜂粮和天然蜂粮部分营养成分进行初步比对研究。主要研究结果如下:(1)以天然蜂粮作为参考,分离并研究蜂粮中含有的微生物,确认其分属杂曲霉Aspergillus versicolor;米曲霉Aspergillus oryzae;红酵母属Rhodotorula;干酪乳杆菌鼠李糖亚种Lactobacillus rhamnosus;布氏乳杆菌Lactobacillus buchneri;植物乳杆菌Lactobacillus Plantarum;嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus;乳酸球菌Lactococcus garvieae;巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。(2)对分离鉴定的菌5、6、7、8、9、10、12七种乳酸菌株进行产酸活性测试,通过测定培养液pH值和可滴定酸,菌8的产酸活性最强。测定乳酸菌的抑菌活性时,7株乳酸菌对金黄色葡萄球菌均存在有一定的抑制作用;菌6外的乳酸菌对大肠杆菌也存在有明显的抑制作用;另外菌7对枯草芽孢杆菌表现有抑菌活性,而其余菌株对其无明细抑制作用。对指示真菌的抑菌活性具体为,菌6、7、8、12对啤酒酵母的抑制作用较强,其余菌株未检测到对其的抑菌活性;菌5、6、8、10等对假丝酵母菌有抑制作用。综合乳酸菌的产酸活性和抑菌活性,最终选择菌8作为发酵性能优良的乳酸菌株,并测定出该菌株最适生长温度为35℃,pH值为6。(3)设计实验优化乳酸菌在小型液态发酵罐中的发酵条件。以乳酸菌活菌数、感官评分等试验评价指标,确定发酵的接种方式为乳酸菌单独发酵。以单因素试验结果为基础,对蜂粮液态发酵工艺进行响应面分析,通过求解乳酸菌活菌数(10~7cfu/g,以Y_1表示)与感官评分(Y_2)对自变量装液量(A)、乳酸菌接种量(B)、发酵温度(C)和搅拌转速(D)的多元回归方程,得到实际最优提取条件为:装液量(v/m)为8.4、乳酸菌接种量(v/v)为10.3、发酵温度为33℃、搅拌转速为436 r/min、发酵周期为4天。(4)通过检测还原糖、总糖、粗脂肪、粗蛋白、α-氨基酸等指标评判人造蜂粮和天然蜂粮的营养价值,发酵后的人工蜂粮总糖增加了22.45%,粗脂肪降低了0.58%,粗蛋白增加2.18%,氨基酸总量增加0.49%,由此可以看出,花粉经过发酵后,各种营养成分有了较大的改变。实验采用SDS—PAGE电泳法,发现发酵成为蜂粮后未见原花粉中相对分子量为23 kD的蛋白,由于有报道己分离并确定出致敏蛋白是一些相对分子质量在20 kD~40 kD的酸性蛋白,因此一定程度地说明了发酵后花粉的致敏性蛋白被消除,但是需要在动物上进一步实验才能加以验证。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1;Q93
【图文】：

菌落形态,蜂粮,菌落形态,样品

图 2.1 天然蜂粮样品菌落形态(A：孟加拉红培养基；B：MRS 培养基；C：MC 培养基；D：LB 培养基)Fig.2.1 Colony morphology of natural bee bread samples(A: Bengal red medium; B: MRS medium; C: MC medium; D: LB medium)通过对天然蜂粮样品中的菌种进行分离，涂板后观察菌落形态特征，将不的菌落依次编号为菌 1~12。2.5.2 基因组提取：对 12 种初步分离的菌落提取基因组 DNA。

电泳图,电泳图,基因组,菌落

图 2.2 菌落基因组电泳图（1-12 泳道分别对应 1-12 号菌落编号；Marker: 1 kb DNAMarker）Fig.2.2 Colony genome electrophoretic diagram(Lanes 1-12 correspond to colonies number 1-12 respectively；Marker: 1 kb DNA Marker)结果：成功提取了 12 种菌落的基因组 DNA，-20℃保存备用。2.5.3 特异性引物的 PCR 扩增：以 1-12 号菌的基因组作为模板，用 Its1 和 Its4 进行 1~4 号菌的 PCR 反应，引物 gyrb 进行 5~12 号菌的 PCR 反应，以期获得清晰的特异性条带，为后续研奠定基础。

【参考文献】