产单宁酶菌核青霉发酵条件优化及酶学性质研究

发布时间：2020-06-22 15:41

【摘要】：单宁酶(EC 3.1.1.20),全称单宁酰基水解酶(Tannin Acyl Hydrolase),是一类能够水解没食子单宁分子中的酯键、缩酚键和糖苷键,生成葡糖糖和没食子酸及其他醇类化合物。另外,单宁酶能水解表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG),还可以催化没食子酸丙酯的合成,它在食品、化工、饲料、医药等领域都有重要应用。我们发现茶树内生真菌菌核青霉AHAUCHA 001具有产生单宁酶的能力,我们对该菌的产酶条件进行了研究,并对该菌所产单宁酶进行了分离纯化,研究了相关的酶学性质,研究结果报告如下。对菌核青霉AHAUCHA 001固态发酵产单宁酶工艺参数进行了研究:培养时间72 h,盐溶液pH6.0,培养温度28℃,五倍子粉含量40%(w/w),额外添加氯化铵2%(w/v),不添加额外碳源,接种量2 mL(4×10~7个孢子/mL),经过优化后单宁酶酶活达到131.01 U/gds,是优化前的6.26倍。菌核青霉AHAUCHA 001菌株液态发酵产单宁酶参数优化:培养时间96 h,盐溶液pH6.0,培养温度31℃,单宁酸含量1%(w/v),0.4%(w/v)的硝酸钠作为氮源,可溶性淀粉2%(w/v)作为碳源,转速180 r/min,经过优化后单宁酶酶活为42.11U/mL,是优化前的12.20倍。采用硫酸铵沉淀法、分子筛层析法(葡聚糖凝胶G-100)、离子交换层析法(DEAE-纤维素)部分纯化单宁酶,最终的酶活力回收率为16.84%,纯化倍数4.77倍。实验单宁酶由572个氨基酸组成,相对分子质量为62.396 KDa,预测等电点为4.66。酶学性质研究结果表明,菌核青霉AHAUCHA 001所产单宁酶的最适反应温度为40℃,热稳定性良好。单宁酶催化反应的最佳pH为5.0,在pH5.0-7.0之间的稳定性较好。以没食子酸丙酯为底物时,Km为0.929 mmol/L,Vmax为102.041μmol/L·min。有机溶剂对单宁酶催化活性具有一定的影响,除丙酮的影响不显著以外,其他有机溶剂在一定程度上降低了单宁酶的活性,其中甘油的抑制作用最为明显,抑制率达19.87%。与文献报道相比,本研究表明,在最佳的条件下,菌核青霉AHAUCHA 001是一种具有实用价值的单宁酶生产菌株。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ925
【图文】：

分子结构图,鞣花酸,没食子,没食子酸

(b)没食子酸(Gallic acid) (c)鞣花酸(Ellagic acid)图 1.1 1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖、没食子酸和鞣花酸分Fig.1.1Molecular structure of 1,2,3,4,6-O-pentagalloyl glucose、Gallic acid an物对单宁的抗性工业生产中，人们从自然中提取了很多天然化合物，利用它保质期，植物中的单宁物质亦有此功能。研究表明，不同种，其中，水解型单宁的抑菌能力比缩合单宁能力稍强一点，，其对寄生虫的入侵也具有一定抵抗能力[10]。彭凯[11]对豆科行了研究，结果表明，该植物中的单宁物质具有较强抗菌活合能力，显著提高了青贮发酵产品的品质，同时也改善了动很多微生物对单宁具有一定的抗性，有些霉菌甚至能通过摄生长。这是由于这部分微生物能够产生某些胞外化合物，与而提高其对单宁物质的耐受能能力。还有一些微生物能产生物质，使其分解成小分子化合物，从而提高自身对丹宁物质的

青霉,菌核,单宁酶,图注

中心颜色较深，边缘颜色较浅，有渗出液。菌落质地为束状和絮状(图4.1.a)。对菌核青霉 AHAUCHA 001 进行显微观察发现其菌丝各细胞之间有横隔膜，分生孢子梗顶端生有帚状枝，在瓶梗上着生分生孢子链，分生孢子为球形，呈绿色(图 4.1.b，c)。结合本实验室前期对该菌株进行的分子生物学鉴定，进一步证明该菌株为菌核青霉。根据这一结果，按照中国典型培养物保藏中心样品要求制作斜面，送样进行保藏。4.1.2 菌核青霉 AHAUCHA 001 产单宁酶能力的验证菌核青霉 AHAUCHA 001 在含单宁酸的孟加拉红培养基上培养 3 d 后，菌落周围的单宁酸被水解，产生明显透明圈(图 4.1.d)。说明菌核青霉 AHAUCHA 001 在生长过程中能够产生胞外单宁酶将菌落周边的单宁酸水解并加以利用。图 4.1 菌核青霉 AHAUCHA 001 形态及产单宁酶鉴定Fig.4.1.Culture and microscopic characteristics of AHAUCHA 001 and the identification of the ability of producing tannase图注:其中 b、c 是用数码显微镜拍摄的图片，放大倍数为 400。

【参考文献】