酿酒酵母终止子的人工设计及在途径优化中的应用

发布时间：2020-06-22 21:52

【摘要】：RNA聚合酶II转录的终止代表转录循环的最后一步。真核生物终止子通过影响mRNA的稳定性、转录效率和位置对转录和翻译过程起到重要的调控作用。本论文依据酿酒酵母终止子关键核心区的序列和结构特点,按照可调节、可控制等原则设计人工终止子,对酿酒酵母人工终止子进行克隆和表征,以番茄红素生物合成途径在酿酒酵母中的精细调控为验证对象,研究人工终止子对代谢途径的调控规律和对合成途径代谢流的调节效率。主要结果如下:(1)将合成的含有不同linker 1序列的人工终止子与含有中等强度的启动子TYS1p和绿色荧光蛋白基因eGFP的验证载体连接,筛选得到了266个人工酿酒酵母终止子,建立了人工终止子文库。以eGFP基因的荧光蛋白表达强度(FI)作为人工终止子强度的表征指标,酵母人工终止子的强度范围为2.3648~3.5270,平均荧光强度值为3.0719。(2)通过对人工终止子测序及对终止子linker 1序列分析发现,人工终止子的强度随着终止子的linker 1序列GC含量的升高而降低。统计文库中的88个强人工终止子,90个中等强度人工终止子和88个弱人工终止子发现,在弱人工终止子linker 1序列中的任何位置,碱基G的出现概率总是大于强终止子中相应位置碱基G的出现概率。且人工终止子强度随着linker 1序列中碱T的增加而增加。通过改变酵母人工终止子的茎长(由linker 2序列构成)发现,茎长的改变对不同强度的人工终止子有不同程度的影响。弱终止子和中强终止子茎长的改变能导致mRNA表达水平和蛋白质产量的升高,表明终止子的强度可通过改变终止子的茎长来调节。(3)以番茄红素外源合成途径为验证对象,采用不同强度的人工终止子设计平行实验,构建由不同强度人工终止子控制下的基因表达模块,验证人工终止子在途径工程中的应用潜力,发现使用中等强度终止子T-307的菌株控制番茄红素合成途径表达时,合成的番茄红素产量达到了26.72 mg/L,比使用弱终止子T-414的菌株产量提高了34.74%。研究说明,人工终止子的强度具有灵活的调节性,在基因表达和代谢途径精细调控中具有较大的应用潜力。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ920.1
【图文】：

番茄红素在酿酒酵母体内的生物合成途径Fig1-2BiosynthesispathwayoflycopeneinS.cerevisiae

标准曲线

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本文编号：2726294