改造谷氨酸棒杆菌生产L-异亮氨酸及PHA

发布时间：2020-06-23 14:06

【摘要】：L-异亮氨酸属于支链氨基酸,必需氨基酸,作为大宗传统工业微生物发酵氨基酸在食品、医药制剂、饲料等方面已有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)IWJ001是本实验室研究多年的L-异亮氨酸生产菌株,针对该菌株的代谢研究已完成RNA-seq转录组数据和二维电泳联用MALDI-TOF蛋白组数据,本研究以蛋白组学数据为切入点,在谷氨酸棒杆菌IWJ001中构建以强化L-异亮氨酸生产为目标的一系列基因工程菌株,同时针对研究过程中发现的科学问题进行了假设的提出和初步验证。主要研究结论如下:(1)通过强化磷酸戊糖途径碳流来强化L-异亮氨酸生产。对基因工程菌IWJ001/pDXW-8-gnd、IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp和IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp-pgl重组菌株的生产性能进行了初步评估:发现单基因表达菌株在胞内NADPH水平、前24 h L-异亮氨酸产量具有优势;双基因共表达菌株在产率系数方面具有优势;三基因共表达菌株在代谢途径基因转录水平方面具有优势,L-异亮氨酸产量达到10.9 g/L,比对照组提高65%。IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp-pgl在补料分批发酵中,L-异亮氨酸生产能力达到0.345 g/L/h、产率系数达到0.138 g/g、L-异亮氨酸产量达到29.0 g/L,L-异亮氨酸产量比对照组提高21%。(2)构建了IWJ001/pDXW-8-cysK以研究半胱氨酸合成酶A的过表达对L-异亮氨酸产量的影响。IWJ001/pDXW-8-cysK摇瓶发酵L-异亮氨酸产量提高了26.5%,产率系数提高了10.5%,L-异亮氨酸合成途径基因aspC、lysC、hom、thrB、ilvA、ilvBN的转录水平分别提高了2.0、5.6、7.2、4.4、3.5、7.5倍。证明CysK过表达对于L-异亮氨酸合成途径碳流有促进作用。在细胞培养期间观察到细胞生长模式为“先抑后扬”,同时细胞形态发生显著变化即在延滞期和对数前期,细胞形态变得更粗、大、长。同时IWJ001/pDXW-8-cysK细胞菌膜形成能力显著降低,无肉眼可见菌膜形成,通过定量分析发现IWJ001/pDXW-8-cysK的菌膜形成能力下降71.3%。通过对膜渗透性进行定量分析发现IWJ001/pDXW-8-cysK的膜渗透性提高15.8%。(3)通过异源表达来自罗氏真养菌的phaCAB基因簇,构建了一株谷氨酸棒杆菌聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)和L-异亮氨酸的基因工程联产菌株。摇瓶发酵水平L-异亮氨酸产量提高44%,达到9.58 g/L,产率系数比对照组提高65%,L-异亮氨酸合成途径基因转录水平小幅提高。此外分别构建了单表达phaA和双表达phaAB的菌株IWJ001/pDXW-8-phaA和IWJ001/pDXW-8-phaAB,通过摇瓶发酵发现只有IWJ001/pDXW-8-phaCAB可以显著提高L-异亮氨酸产量并在胞内积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)颗粒。在补料分批发酵中,IWJ001/pDXW-8-phaCAB的L-异亮氨酸产量达到30.1 g/L,产率系数达到0.129 g/g,比对照组提高27%。(4)对胞内积累的PHA颗粒进行鉴定,发现其单体构成为3-羟基丁酸和3-羟基戊酸,即证明胞内颗粒为PHBV。定量实验确定其3HV的摩尔比例为58.1%,PHBV占细胞干重比例28.7%。在ATCC13869中构建的ATCC13869/pDXW-8-phaCAB使用同样的培养条件摇瓶发酵,胞内积累的颗粒为PHB而非PHBV。对IWJ001胞内丙酰辅酶A进行定量发现IWJ001中的丙酰辅酶A较ATCC13869提高了16.9倍,达到了0.95 mg/L(1.35μM),并进一步通过转录组数据和补料分批发酵数据进一步推测了丙酰辅酶A的来源是2-酮丁酸。通过转录组学数据发现合成丙酰辅酶A的代谢通路极度活跃,相关的编码基因prpB、prpC、prpD、dtsR1和msmA分别上调了338、104、56、4.6和4.9倍。在补料分批发酵中,3HV比例与L-异亮氨酸合成过程高度相关,发酵过程中3HV比例在35.1%-75.2%之间变化,PHBV产量为15.2 g/L,占细胞干重的20%,其中3HV摩尔比例为75.2%,是目前以葡萄糖为碳源的最高3HV比例。进一步敲除丙酰辅酶A分解代谢基因prpC,构建了IWJ001ΔprpC,较IWJ001的丙酰辅酶A水平提高了3.8倍。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ922
【图文】：

聚合物结构,通式,自然条件

解性、生物相容性以及 PHA 塑料的热加材料和生物可降解包装材料。除此之外，性光学活性等高附加值性能，所以除了可广泛应用于粘合材料、医学植入材料[36]产品、自动化产品、精细化学等方面。目BHHx[39]三种 PHA 材料，其单体分别含有 1-2 所示，聚酯单体的羧基与相邻单体的A 的主要区别是不同的 C3 位侧链基团，羟基丁酸酯（PHB），侧链基团可以有很多 3 之间变化，另外根据单体的不同排列方嵌段共聚物等多重结构，上述大量的侧链以以两个或两个以上的种类，多种比例，化接近于无限。这种多元化的结构带来了多样化，使其在实际的应用中较之其他材

生物合成途径,辅酶

江南大学博士学位论文酰辅酶 A 或一个乙酰辅酶 A、一个丙酰辅酶 A，产生乙酰乙酰辅酶 A 或酮基戊 A，第二步由依赖于 NADPH 的乙酰乙酰辅酶 A 还原酶(由 phaB 编码)催化立体反应，从乙酰乙酰辅酶 A 或酮基戊酰辅酶 A 产生(R)-3-羟基丁酰辅酶 A 或(R)-3-酰辅酶 A。第三步依赖 PHA 聚合酶(由 phaC 编码)的作用下将(R)-3-羟基脂酰辅体聚合，产生 PHAs，同时释放游离的辅酶 A。在某些微生物比如恶臭假单胞菌真养菌的代谢网络中存在 PHA 合成途径，而在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌则并不A 合成酶。

【参考文献】