虎斑乌贼生殖腺多肽的制备、纯化及其抗氧化活性的研究

发布时间：2020-06-23 07:30

【摘要】：为了实现乌贼副产物的高值化利用,本文以虎斑乌贼(Sepia pharaonis)生殖腺为原料,采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)液态发酵法制备抗氧化肽,对乌贼生殖腺抗氧化肽的体外抗氧化活性及其稳定性进行了研究,并采用多种分离技术对抗氧化肽实现了逐级分离纯化。主要的研究内容和结论如下:(1)虎斑乌贼生殖腺具有高蛋白(62.71 g/100g)、低脂肪(0.52 g/100g)的特点,其氨基酸种类丰富、组成合理,可作为一种优质的蛋白源用于抗氧化肽的开发。以虎斑乌贼生殖腺作为唯一的发酵基质,研究了枯草芽孢杆菌发酵过程中相关指标的动态变化,发现枯草芽孢杆菌在发酵培养基中生长良好,且具有一定的产蛋白酶能力,能够将乌贼生殖腺蛋白降解为小分子多肽和氨基酸,进而引起发酵液中氨基酸态氮含量、羟自由基清除率和还原力的动态变化。以发酵液的蛋白酶活力和非蛋白氮含量为评价指标,研究了底物浓度、培养基的初始pH值、发酵温度及发酵时间对发酵过程的影响。在上述单因素实验的基础上,通过正交试验进一步优化发酵工艺,得到枯草芽孢杆菌发酵乌贼生殖腺的最适条件为:发酵底物浓度为30 mg/mL,培养基的初始pH值为6.0,发酵温度为34℃,发酵时间为60 h。在此条件下,发酵液的蛋白酶活力为66.66 u/mL,非蛋白氮含量为1.10 mg/mL。(2)乌贼生殖腺多肽的粗蛋白含量为52.37 g/100g,蛋白质利用率为34.64%,其氨基酸组成中,赖氨酸和天冬氨酸含量最高,疏水性氨基酸和抗氧化氨基酸的含量分别占总氨基酸的39.1%和63.3%,具有良好的抗氧化潜力。乌贼生殖腺多肽具有一定的体外抗氧化活性,其DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和亚铁离子螯合率的IC_(50)值分别为14.99、21.22、7.95和1.75 mg/mL,但其还原力相对较弱,AC_(0.5)值为41.32 mg/mL。对其抗氧化活性的稳定性进行了研究,发现温度、食品配料(包括NaCl、蔗糖和柠檬酸)、防腐剂(包括苯甲酸钠和山梨酸钾)及金属离子中的K~+、Mn~(2+)、Ca~(2+)的对乌贼生殖腺多肽的活性保持率影响不大,而强酸环境和Zn~(2+)对其活性保持率影响较大。(3)以DPPH自由基清除率为主要的评价指标,采用超滤法、Sephadex G-25凝胶过滤层析法和RP-HPLC对乌贼生殖腺多肽进行逐级分离纯化,得到的组分SPGPs-2D-2具有最高的DPPH自由基清除率(70.61%,1 mg/mL),与分离前相比(67.26%,30mg/mL),提高了至少30倍,乌贼生殖腺抗氧化肽得到了有效富集。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.63;TQ936.16
【图文】：

色谱图,流动相,乙腈,甲醇

第四章乌贼生殖腺多肽的分离纯化4.4.3 RP-HPLC 分离纯化 SPGPs-2DRP-HPLC 是根据样品中各组分的极性差异而实现分离的色谱技术，具有分辨率高、分析速度快、回收率高等特点，广泛应用于多肽的分离纯化和制备。将凝胶过滤层析分离后得到的抗氧化活性最高的组分 SPGPs-2D 利用 RP-HPLC 进一步分离。4.4.3.1 RP-HPLC 的分离条件优化在 RP-HPLC 的分离纯化中，影响样品分离效果的因素有很多，本次实验选择流动相和洗脱流速两个主要的影响因素对 SPGPs-2D 的分离条件进行初步优化。（1）流动相的选择（A）

色谱图,流速,色谱图,洗脱

三氟乙酸水溶液（A）、5%甲醇和 95%三氟乙酸水溶液（B），洗脱流速为 1 mL/min 时，观察其色谱图的峰形变化。与甲醇相比，乙腈造成的色谱柱背压相对更小，流动相流动过程中的阻力减小，使得纵向扩散减少，因此最终的峰形更加窄而高。但甲醇对样品的分离度高于乙腈，因此最终选择 5%甲醇和 95%三氟乙酸溶液作为流动相。（2）流速的选择洗脱流速也是影响 RP-HPLC 中样品分离的重要因素之一。流速过低时，样品的保留时间过长，使得样品的分离效率降低。流速过高时，柱背压增大，影响样品的分离效果。如图 4-4 所示，固定流动相为 5%甲醇和 95%三氟乙酸，与洗脱流速为 1mL/min 的色谱图（见图 4-3（B））相比，洗脱流速为 0.5mL/min 时样品的分离度更高，分离效果更好。因此，选择洗脱流速为 0.5mL/min 作为下一步分离纯化的参考值。根据分析柱与制备柱之间流速的线性放大规律，最终选择洗脱流速为 1mL/min 作为 RP-HPLC 制备柱的最佳流速。

【参考文献】