苏云金芽胞杆菌BMB171合成黑色素机制研究

发布时间：2020-06-27 11:32

【摘要】：黑色素在自然界广泛存在,微生物、动物、植物以及人类均可产生黑色素。研究表明,生物体合成的黑色素具有抗氧化、抗紫外辐射、结合重金属离子等许多重要的生理功能,可提高生物的生存能力及环境适应性。苏云金芽胞杆菌(Bt)是一种伴随着芽胞的产生形成晶体蛋白的革兰氏阳性细菌,世界上使用最广范的生物杀虫剂。然而,Bt形成的具有杀虫活性的伴胞晶体作为Bt制剂的主要活性成分在施用的过程中易受到环境如紫外线的影响而降低杀虫效果。研究者通过多种方法来提高Bt制剂的抗紫外能力,其中之一便是利用黑色素作为Bt的紫外防护剂来增加Bt杀虫剂的持效性。前人研究表明苏云金芽胞杆菌绝大部分菌株通过高温诱导可获得产黑色素表型。本室前期通过高温诱导传代培养,得到BMB171的高产黑色素突变株BMB181,试验证实其无需诱导便可在LB培养基、ICPM培养基和发酵培养基中产生黑色素,并保持了BMB171良好的转化特性和表达性能,而且生物检测结果也表明BMB181所产的黑色素具有保护晶体蛋白活性免受紫外线破坏的功能。然而,目前关于苏云金芽胞杆菌的产黑色素的确切机制不甚明了。解析苏云金芽胞杆菌黑色素的产生机制不仅能够增加我们对Bt的认知,更为构建具抗紫外线能力的Bt工程菌提供理论基础,对Bt制剂在农业生产过程中的应用都有很广泛的意义。自然界中的黑色素主要分类为真黑素和褐黑素和异黑色素,其中DHN黑色素,HPQ黑色素和脓黑色素属于异黑色素。目前,已报道了真黑素、DHN黑色素、HPQ黑色素和脓黑色素的生物合成途径。参与这些黑色素合成途径相关的基因是已知的。前期研究发现,编码酪氨酸酶的基因存在于BMB171基因组序列中,但突变菌株BMB181(BMB171的衍生物)在敲除编码酪氨酸酶的基因后仍产生黑色素。据此,我们推测Bt中存在与酪氨酸酶催化的黑色素合成途径不同的其他黑色素生成途径。本研究以高产黑色素菌株BMB181为主要研究对象,对苏云金芽胞杆菌生产黑色素合成机制开展了研究,主要工作及结果如下:1.苏云金芽胞杆菌可通过尿黑酸双加氧酶突变产生黑色素对苏云金芽胞杆菌BMB171基因组序列进行分析,发现其中存在这种由尿黑酸介导的酪氨酸代谢通路。在人体中这种由尿黑酸介导的酪氨酸代谢途径需要六种酶的共同作用。其中尿黑酸双加氧酶是催化尿黑酸开环反应的关键酶。当尿黑酸双加氧酶失活时,会导致尿黑酸的积累并氧化聚合形成脓黑色素,最终致使人患尿黑酸症。我们据此推测苏云金芽胞杆菌也可产生以尿黑酸为前体物的脓黑色素。利用温敏型质粒构建hmgA基因插入突变体BMB171ΔhmgA,发现突变株BMB171ΔhmgA与BMB181具有相同的产黑色素表型。高效液相结果表明,突变株BMB171ΔhmgA与BMB181在生长过程中均会产生尿黑酸的积累。DNA测序结果表明BMB181中的hmgA基因存在一个核苷酸的改变(815C→T)导致BMB181中尿黑酸双加氧酶一个氨基酸发生了错义突变(272G→E)。回补试验证实菌株BMB171中尿黑酸双加氧酶在菌株BMB181中表达后可以恢复Bt菌株的不产黑色素表型。对其他的产黑色素Bt菌株CT137及CT153的尿黑酸双加氧酶基因进行测序发现CT137 HmgA中氨基酸发生错义突变(G241D),而CT153HmgA中由于其基因中一个核苷酸的插入导致发生终止突变。对CT137及CT153进行回补试验后,重组菌株不产黑色素。这些说明尿黑酸双加氧酶单点突变可导致苏云金芽胞杆菌产生黑色素。2.HmgA中的6个氨基酸残基发生单点突变时会导致黑色素的形成二级结构预测发现HmgA中氨基酸残基Gly272位于β19-β20 loop中,基于BMB181中的HmgA发生G272E突变导致黑色素产生的特点,随机选择了BMB171HmgA中14个位于β-βloop上或者位于β折叠末端的氨基酸残基构建丙氨酸扫描突变体(G89A、N116A、G119A、D120A、G128A、F136A、K219A、G241A、P245A、H261A、N300A、G323A、H334A及P336A),通过回补试验研究这些突变体对黑色素产生的影响,结果发现有6种突变体(G128A、F136A、G241A、H261A、H334A及P336A)对黑色素的形成有影响。这说明这6种突变体会导致HmgA失活,使Bt产生黑色素。虽然通过多序列比对发现这14个位点在HmgA中高度保守,但是从结构与功能关系方面来说,位点G128、F136、G241、H334及P336更为保守。对NCBI数据库中公布了全基因组序列的40余株苏云金芽胞杆菌菌株进行分析,发现由尿黑酸介导的酪氨酸代谢通路的编码相关蛋白的基因(hmgA,hppD及fahA)在上述所有菌株中普遍存在。同时分析发现尿黑酸双加氧酶基因在70种不同血清型Bt菌株中存在。这说明苏云金芽胞杆菌具有通过突变尿黑酸双加氧酶产生以尿黑酸为前体物的黑色素的潜力。通过生物信息学方法分析了Bt尿黑酸双加氧酶的特点包括疏水性、保守结构域、进化树分析、氨基酸的多态性及HmgA的三维结构。我们发现HmgA为亲水性蛋白,属于Cupin-like超家族蛋白。三维结构显示HmgA由两个三聚体结合形成六聚体结构。活性中心金属离子Fe~(2+)与3个氨基酸残基His298、Glu305及His334配位结合。氨基酸多态分析显示多态位点有19个(S23A、S54A、L56V、S71A、S80N、S83T、I87V、I93M、S105T、D110N、T138M、V169L、L199I、E213D、H227Y、A343G、Q384E、Q384D、Y387H、T388N)。然而,这些位点的不同对黑色素的产生与否并不产生影响,所有这些菌株均不产生黑色素。这说明Bt中的尿黑酸双加氧酶功能具有一定的保守性,以至于我们从自然界中分离到的Bt菌株绝大多数都不产黑色素。3.Bt中存在其他不同于pyomelanin的黑色素产生机制前期已报道Bt经高温酪氨酸诱导产生可黑色素,然而这种黑色素的产生机制不是很清楚,推测是在高温条件下通过酪氨酸酶催化酪氨酸产生的黑色素。然而酪氨酸酶基因在Bt菌株中并不多见,这说明Bt中可能存在其他与酪氨酸酶有相似活性的蛋白。分析苏云金芽胞杆菌BMB171中基因组序列的编码区发现其中存在具有多铜氧化酶结构域的Laccase-like蛋白。对该蛋白的三维结构及活性位点进行了相关的分析,其结构域中含有金属离子Zn~(2+)结合活性位点,4个半胱氨酸残基Cys181,Cys182,Cys239及Cys242与Zn~(2+)配位结合。基因组分析结果显示该基因广泛存在于苏云金芽胞杆菌中。将Laccase-like蛋白表达及纯化并进行活性检测,初步确定其具漆酶活性。该蛋白与黑色素的关系需进一步探索。另外通过筛选YBT-1518干扰突变体,我们发现三株突变体产生黑色素。这三株突变体被干扰的基因分别是YBT1518_07140(烯酰基-(酰基载体蛋白)还原酶(Fab)),YBT1518_21755(XRE(Xenobiotic Response Element)家族调控因子)和YBT1518_23810(位点特异性整合酶)。这些蛋白与黑色素的关系目前还没有报道。本研究以高产黑色素Bt菌株BMB181为研究重点,阐明了该种黑色素在Bt中的形成机理。这不仅丰富了对Bt黑色素形成机制多样性的认识,同时也为采用分子遗传学手段构建高产黑色素的基因工程菌提供理论基础。本研究为在HmgA中进行点突变构建抗紫外线的Bt菌株提供理论依据,也为研究人类导致尿黑酸尿症的基因提供了一个有意义的模型。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ453
【图文】：

核磁共振,黑色素,单体结构,毛盘

N2，其化学结构如图1-1 a所示，其包含吲哚醌结构[17]。另有Ye等从粒毛盘菌YM-404（Lachnum YM-404）分离提纯得到黑色素LEM404-a，结合红外、紫外、元素分析、质谱、气相色谱质谱联用、核磁共振等方法研究分析推测其化学分子式为C22H12N2O4S2，化学结构如图1-1 b所示，其基本骨架由吡咯环及苯环结构组成[18]。Song等从粒毛盘菌YM226（Lachnum YM226）分离提纯得到细胞内黑色素LM，化学结构如图1-1 c所示[19]。Zong等从粒毛盘菌YM205（Lachnum YM205）分离提纯得到细胞内黑色素LIM205，其分子量为522 Da，分子式为C28H14N2O7S

示意图,分子结构式,黑色素,示意图

[21]。黑色素单体经过聚合形成纳米粒子并组装成黑色素颗粒（图1-2）[22]。这些研究表明黑色素结构具有复杂性及多样性。图 1-1 黑色素单体结构a: LEM346的分子结构式[17]b: LEM404-a的分子结构式[18]c: LM的分子结构式[19]d:LIM205的分子结构式[20]e: 屎壳郎中黑色素的分子结构式[21]Fig. 1-1 Proposed structures of melanin monomera: Structure of LEM346 b: Structure of lem404-a c: Structure of LM d: Structure of LIM205 e:Structure of melanin in dung beetle

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