亮氨酸脱氢酶的定向进化及其转氨脱氨催化的应用研究
发布时间：2020-07-01 18:44
【摘要】：亮氨酸脱氢酶(LeuDH,EC 1.4.1.9)是一种广泛存在于生物体内并参与多种支链氨基酸合成的酶。能可逆催化L-型氨基酸氧化脱氨基合成α-酮酸。利用亮氨酸脱氢酶还原氨化α-酮酸合成非蛋白源氨基酸得到了广泛的研究和开发,如L-叔亮氨酸和L-正缬氨酸的合成等;而利用亮氨酸脱氢酶氧化脱氨基L-氨基酸合成α-酮酸的研究较少,其产物α-酮酸可以用于饲料、食品添加剂、药物和化学品的合成过程,并在人类健康方面具有重要的作用。本研究以来源于短小芽孢杆(Exiguobacterium siricum255-15)亮氨酸脱氢酶(简写为EDH)为研究材料,通过对EDH的定向进化,筛选高酶活的EDH突变株,应用于亮氨酸脱氢酶生物合成α-酮酸应用。本论文的主要研究内容如下:1、构建表达质粒pET28a-EDH,并转化到大肠杆菌BL21中,得到高效表达的重组菌株BL21(pET28a-EDH),对目标蛋白纯化后,对EDH酶学性质进行研究,结果表明对于转氨和脱氨反应,亮氨酸脱氢酶催化反应的最适pH同为9.5、最适温度分别为45℃和50℃,且在还原胺化反应方向上,具有更好的pH稳定性。分别对亮氨酸脱氢酶的转氨和脱氨反应的动力学参数进行测定,脱氨反应中亮氨酸脱氢酶对NAD~+和L-亮氨酸的Km值为0.656和0.762mM,说明其亲和性良好。而转氨反应中亮氨酸脱氢酶对NADH及TMP(三甲基丙酮酸)Vmax较大,分别为333.3和55.6 μmol/(min·mg),说明其在催化TMP合成L-叔亮氨酸方向具有巨大潜力。通过对亮氨酸脱氢酶的催化底物谱测定,结果发现亮氨酸脱氢酶对L-型氨基酸就有较为广泛的底物谱,但对D-型氨基酸没有催化活性,且D-型氨基酸会抑制其活性。当在亮氨酸脱氢酶催化L-亮氨酸时,添加同等浓度的D-亮氨酸,其酶活性降低近50%。2、建立了一个简单可行的适用于亮氨酸脱氢酶的高通量筛选方法。即在诱导突变菌体表达酶蛋白的同时,在培养基中添加甘氨酸和tritonx-100,使重组细胞快速裂解释放目标蛋白,便于突变酶的活性检测和筛选,通过本实验建立的筛选方法对1055个EDH突变子进行筛选,筛选到一株EDH突变子K172R,对L-亮氨酸的催化活性为14.15 U/mg,较野生型酶活性提高了 45.9%,对底物L-亮氨酸和辅酶NAD~+的与野生型的Km值分别为0.313和0.5 mM,与野生型酶相比具有更高的亲和性。将突变子K172R应用于催化L-亮氨酸脱氨基反应合成α-酮异己酸反应,构建了 EDH偶联乳酸脱氢酶(LDH)作为辅酶再生循环的双酶体系用于α-酮异己酸的合成,经过初步催化实验,反应24h后,突变子K172R催化L-亮氨酸得到产物α-酮异己酸的产量为7.22 mM,较野生型EDH的催化合成产量提高了 29.02%。3、构建EDH和葡萄糖脱氢酶(GDH)双酶偶联反应体系,并对催化合成L-叔亮氨酸反应条件进行了优化。结果发现最优的底物TMP和葡萄糖的摩尔比为1:2,最佳的反应温度和pH分别为30℃和pH 10.0。在此条件下反应7h,底物转化率达到100%,产物L-叔亮氨酸浓度达到100 mM,其光学纯度大于99%(e.e.%)。与双菌体系相比,双质粒系统使用更低的菌体浓度,达到更高的反应效率,生产过程更为简单。
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q814;TQ925
【图文】：
（ＤＡＰＤＨ）g巨够还原l#化ａ－嗣酸还原l#化得到Ｄ－氛基酸，２，６－二氨基庚二酸脱逡逑氢酶是微生物中生产合成Ｌ－赖氨酸的代谢途径中关键酶［４８］，该酶能够将Ｃ＝０还逡逑原氨化为Ｃ－ＮＨ２，其中心碳原子的构型为Ｄ型，如图１．４所示。而且文献报道的逡逑ＤＡＰＤＨ的来源只有少数几种，是分别是来源于谷氨酸棒状杆＠１，嗜热脂肪芽孢逡逑杆菌邋ＵｒｅｉｂａｃｉＨｕｓ邋ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒｉｃｕｓｌ’，嗜热共生菌办灥逡逑／／７r馈贰浚凡蓿保担保荨Ｈ欢模粒校模染哂蟹浅Ｑ细竦牡孜锲住⒔系偷拇呋钚院湾义希危粒模校ǎ龋└敢览敌停拗屏似溆τ茫胁糠盅芯空攵杂冢玻叮被嵬亚忮义厦傅牡孜锲准案谋涓附岷咸匦缘亩ㄏ蚪〉媒虾玫男Ч┐罅似涞孜锲族义虾透附岷咸匦浴ｅ义希
本文编号：2737132
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q814;TQ925
【图文】：
（ＤＡＰＤＨ）g巨够还原l#化ａ－嗣酸还原l#化得到Ｄ－氛基酸，２，６－二氨基庚二酸脱逡逑氢酶是微生物中生产合成Ｌ－赖氨酸的代谢途径中关键酶［４８］，该酶能够将Ｃ＝０还逡逑原氨化为Ｃ－ＮＨ２，其中心碳原子的构型为Ｄ型，如图１．４所示。而且文献报道的逡逑ＤＡＰＤＨ的来源只有少数几种，是分别是来源于谷氨酸棒状杆＠１，嗜热脂肪芽孢逡逑杆菌邋ＵｒｅｉｂａｃｉＨｕｓ邋ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒｉｃｕｓｌ’，嗜热共生菌办灥逡逑／／７r馈贰浚凡蓿保担保荨Ｈ欢模粒校模染哂蟹浅Ｑ细竦牡孜锲住⒔系偷拇呋钚院湾义希危粒模校ǎ龋└敢览敌停拗屏似溆τ茫胁糠盅芯空攵杂冢玻叮被嵬亚忮义厦傅牡孜锲准案谋涓附岷咸匦缘亩ㄏ蚪〉媒虾玫男Ч┐罅似涞孜锲族义虾透附岷咸匦浴ｅ义希
本文编号：2737132
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