重组枯草芽孢杆菌全细胞转化法高效合成N-乙酰神经氨酸

发布时间：2020-07-02 05:56

【摘要】：N-乙酰神经氨酸(NeuAc)是最常见的分布最广的一种唾液酸(SA),占据细胞膜中糖蛋白、糖脂或寡糖的末端位置,在生物学、病理学和免疫学过程中发挥重要作用。同时NeuAc也是母乳寡糖中重要的单糖组成单元,具有促进婴儿大脑发育和增强免疫力等功效。另外NeuAc的衍生物可以作为抗癌、抗粘连和抗病毒药物,也能作为医药治疗中的纳米载体特异性的进行疾病治疗。NeuAc在食用和药用方面的增长需求,对NeuAc的制备方法提出了更高的要求。然而,传统提取、化学法和发酵法合成NeuAc的较低产量和生产效率以及环境污染限制了NeuAc的供应,同时目前全细胞转化法的宿主是大肠杆菌(Escherichia coli),NeuAc合成存在的潜在内毒素污染风险不利于NeuAc在食品和医药方面的应用。在本课题中,我们开发了一种利用食品级安全级菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)全细胞转化生产NeuAc的方法。本论文主要研究内容如下:(1)首先克隆来自鱼腥藻(Anabaena sp.CH1)编码N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)的基因age和来自大肠杆菌(E.coli K12)编码NeuAc醛缩酶(NanA)的基因nanA至表达载体pP43NMK,在枯草芽孢杆菌中构建以N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸为底物合成NeuAc的异源途径。之后比较了7种不同强度的组成型启动子调控AGE和NanA表达,构建得到一系列不同表达强度的重组质粒,以强启动子P_(43)调控AGE和NanA表达的重组菌B6CG/p43AN进行全细胞转化,以1.2 mol·L~(-1)丙酮酸和0.4mol·L~-11 GlcNAc为底物反应48 h得到32.84 g?L~(-1) NeuAc,其中GlcNAc的摩尔转化率为26.55%。(2)为了进一步寻找更优来源的nanA基因,比较了来自大肠杆菌(E.coli K12)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium.glutamicum ATCC13869)和葡萄球菌(Staphylococcus.hominis EFS20452.1)来源的nanA对全细胞转化合成NeuAc的影响。全细胞转化实验结果表明,当采用来源于S.hominis的shnanA时,重组菌B6CG/p43ANsh全细胞转化的NeuAc产量达到46.04 g?L~(-1),相对于表达E.coli K12来源的nanA时提高了40.2%。(3)为了提高NeuAc醛缩酶(ShNanA)的表达水平,筛选10种枯草芽孢杆菌高表达蛋白的编码基因的N-端编码序列,并且将N-端编码序列融合于shnanA的5?-末端调控shnanA表达。通过比较不同N-端编码序列融合于shnanA对重组B.subtilis全细胞转化合成NeuAc的影响,筛选得到一种有效促进shnanA表达和活性的N-端编码序列N1-tufA,重组菌B6CG/p43ANshN1-tufA的shnanA表达由N-端编码序列N1-tufA调控,全细胞转化NeuAc产量达到56.82 g?L~(-1)。(4)通过敲除alsS和alsD基因阻断丙酮酸转化为副产物乙偶姻的代谢途径,阻断B.subtilis自身对底物丙酮酸的消耗问题,得到的重组菌B6CGSD/p43ANshN1-tufA,全细胞转化NeuAc达到68.75 g?L~(-1),其中GlcNAc的摩尔转化率为55.57%。最后对重组菌B6CGSD/p43ANshN1-tufA进行菌体培养时间和全细胞转化条件的优化,包括pH、温度、表面活性剂种类和浓度、菌体浓度和底物浓度。最终NeuAc产量提高了36.41%,达到93.78 g?L~(-1),GlcNAc的转化率为50.54%。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;TQ929
【图文】：

图 1-1 NeuAc 化学结构式Fig. 1-1 The chemical structure of NeuAc-NHCOCH3N-乙酰神经氨酸（NeuAc）-NHCOCH2OH N-羟乙酰神经氨酸（NeuGA-H 3-脱氧-D-甘油-D-半乳-壬酮

意义与研究内容意义图 1-2 枯草芽孢杆菌产 GlcNAc 合成途径Fig. 1-2 GlcNAc metabolic pathway in B. sublitis

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本文编号：2737826