林蛙胶原蛋白多肽的分离纯化、功能性研究及其微胶囊的制备

发布时间：2020-07-08 13:16

【摘要】：本论文课题来源于吉林省科技厅攻关项目(20160204022NY):《林蛙残体胶原蛋白多肽的结构修饰及稳定性关键技术研究》。本研究以酶解过滤得到的具有高生物活性的林蛙胶原蛋白多肽(分子量小于3500Da)为原料,对其进行分离纯化及其功能性等研究。首先优化凝胶层析分离条件得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个组分,利用高分辨液质联用仪(LC-MS)鉴定其氨基酸序列,筛选出各组分的优势序列。其次,对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分的抗氧化和ACE抑制活性进行研究,结合所得氨基酸序列探究抗氧化和ACE抑制活性的构效关系。最后,以林蛙胶原蛋白肽为芯材,制备林蛙肽/微孔淀粉-海藻酸钠微胶囊,考察其在体外模拟胃肠液中的缓释效果。本文的研究内容及对应结果如下:1.利用葡聚糖凝胶层析分离技术分离纯化林蛙胶原蛋白多肽,对层析介质规格、上样量和洗脱流速三个主要条件进行优化,得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分,再对各组分多肽形貌进行扫描电镜分析,最后将三个组分进行LC-MS检测得到各组分的优势氨基酸序列。结果如下:(1)层析分离条件为:层析介质SephadexG25、上样量1500μg、洗脱流速60mL/h时分离效果最好,得到三个组分。(2)混合肽及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的扫描电镜分析结果表明:原混合肽表面形貌呈圆球状,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分表面形貌相似,均是絮状,片状和棒状的混合,彼此间差异不明显。(3)从LC-MS检测所得氨基酸序列中,筛选出Ⅰ组分中的优势氨基酸序列有NMDMPPNK、LDAQVSALEGAR、LEVLEIIMAIFK,分别命名为Ⅰ_1、Ⅰ_2、Ⅰ_3;Ⅱ组分中的优势氨基酸序列有NALSPLK、MLDEVPK、MNAQNVGK,分别命名为Ⅱ_1、Ⅱ_2、Ⅱ_3;Ⅲ组分中的优势氨基酸序列有GGLVGIK、EISSLK、MAAISPK、MANSQLK,分别命名为Ⅲ_1、Ⅲ_2、Ⅲ_3、Ⅲ_4。2.对分离所得的多肽组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行抗氧化活性研究,考察了其对DPPH的清除能力、超氧阴离子的清除能力和还原力,并进一步探索其抗氧化构效关系。结果表明:(1)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分对DPPH清除率分别为74.3%、50.8%、59.0%;还原力分别为0.68、0.32、0.33;超氧阴离子清除率分别为33.4%、12.4%、11.5%,总体来讲,I的抗氧化活性最高。(2)LC-MS检测结果表明三个组分氨基酸序列都含有Leu,Pro,Lys、Arg,这可能是三个组分均有抗氧化活性的主要原因。(3)Ⅰ中优势序列的N端为Leu和酸性氨基酸的酰胺残基天冬酰胺Asn,而Ⅱ、Ⅲ中优势序列的N端多为中性氨基酸Met,这可能是Ⅰ组分抗氧化活性略高于Ⅱ、Ⅲ组分的原因。3.利用高效液相测定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分多肽的ACE抑制活性,并探索其ACE抑制构效关系。结果表明:抑制剂浓度在0~10 mg/mL之间时,随着抑制剂浓度增大,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分ACE抑制率均逐渐增高,且Ⅲ组分的ACE抑制活性始终大于I、Ⅱ组分。LC-MS检测得出的I、Ⅱ、Ⅲ的优势氨基酸序列中,每个组分的优势序列C末端均为Lys或Arg,并且每个序列其C末端三肽位置至少含有一个疏水性氨基酸,这可能是三个组分均具有ACE抑制活性的主要原因。而Ⅲ组分的ACE抑制活性最高,可能是因为其分子量小,具有活性位点暴露多、分子移动快等特点。4.为提高林蛙胶原蛋白多肽在胃肠液内的生物利用率,增强其缓释效果,以海藻酸钠为壁材,微孔淀粉作吸附芯材的载体,利用锐孔凝固浴法制备了微胶囊,在体外模拟胃肠液的实验结果显示:林蛙肽/微孔淀粉-海藻酸钠微胶囊与林蛙肽-海藻酸钠微胶囊在模拟胃液中4h时,累积释放量分别为32%和41%,在模拟肠液中8h时,累积释放量分别为88%和83.6%。有载体的微胶囊在胃液中释放少,在肠液中释放量增加缓慢,说明有载体的微胶囊能起到一定的缓释作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ464.7
【图文】：

流速,洗脱峰,规格

图 2-1 不同条件下的洗脱峰Figure 2-1 Elution peaks under different conditions(a) 层析介质 Sephadex G15，上样量 1000μg，流速 45mL/h；(b) 层析介质 Sephadex G25，上样量 1000μg，流速 45mL/h；(c) 层析介质 Sephadex G25，上样量 1500μg，流速 45mL/h；(d) 层析介质 Sephadex G25，上样量 2000μg，流速 45mL/h；(e) 层析介质 Sephadex G25，上样量 1500μg，流速 60mL/h；。2.4.1.1 层析介质规格的选择上图 2-1 中的 a、b 分别表示 Sephadex G15 和 Sephadex G25 这两种层析介质规格下所得的不同洗脱峰。不同型号的层析介质出现了不同的洗脱峰形状，表明不同层析介质规格有不同的分离纯化效果。而其他分离条件一致，均为检测波长220 nm，层析柱规格为 2.8 cm×80 cm，上样量为 1000μg，流动相速度 45 mL/h

氨基酸序列,组分,混合组分,扫描电镜图

图 2-2 扫描电镜图 A,a 混合组分；B,b.Ⅰ组分；C,cⅡ组分；D,dⅢ组分Figure 2-2 Scanning electron micrograph A, a mixed component; B, b.I component; C, cII component; D, dIII component2.4.3 各组分多肽氨基酸序列分析将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分进行高分辨液质联用后，通过蛋白质库搜索匹配，得知本实验中的林蛙胶原多肽原材料中所含蛋白质种类与种属 Xenopus tropicalis(非洲爪蟾）匹配度高，经 Thermo Proteome Discoverer 2.2 分析软件得出上百条氨基酸序列与其对应的信息。其中测序软件分析所得的 Score Sequest HT 值越高表示可信度越高，测试结果越准确。氨基酸序列的 PSMs 数值越大表示该氨基酸序列的质谱图数目越多，该氨基酸序列在整个测试中出现的频率高，在整个样品中含量占比越大。本实验中以可信度与氨基酸序列的含量为依据，筛选出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组

谱图,谱图,质谱图,一级

23图 2-3 Ⅰ1NMDMPPNK 质谱图（a）一级谱图 (b）二级谱图Figure 2-3 I1NMDMPPNK mass spectrum (a) primary spectrum (b) secondaryspectrum

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