鱿鱼足抗氧化与ACE抑制肽的活性研究及在线筛选

发布时间：2020-07-13 01:57

【摘要】：鱿鱼是一种具有高蛋白低脂肪特点的水产品,因此利用鱿鱼制备生物活性肽具有重要的意义。本文选取北太平洋鱿鱼足和阿根廷鱿鱼足,利用酶解技术,超滤分级技术制备具有抗氧化活性和血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性的多肽,并使用凝胶层析柱分离出鱿鱼足的小分子量的多肽,进一步探究北太平洋鱿鱼足多肽和阿根廷鱿鱼足多肽的抗氧化活性和ACE抑制活性。最后使用计算机方法辅助探索北太平洋鱿鱼肌球蛋白中具有抗氧化活性和ACE抑制活性的小分子肽。主要研究内容如下:(1)鱿鱼足多肽最佳酶解工艺的研究:以水解度(degree ofhydrolysis,DH)为指标,选用木瓜蛋白酶作为酶解用酶。通过响应面分析实验发现添酶量,酶解温度和液料比三个因素对响应值均具有显著性影响,得到北太平洋鱿鱼足最佳酶解条件为添酶量 1.41%(w/w),温度 51.08℃,液料比 2.26:1(v/v),酶解 6h,DH为 30.16±0.31%。阿根廷鱿鱼足的最优参数为添酶量1.43%(w/w),温度50.86℃,酶解6h,液料比2.06:1(v/v),DH为28.98±0.31%。较高DH的鱿鱼足酶解液(squidprotein hydrolysate,SPH)为后续实验提供了基础。(2)鱿鱼足多肽分离纯化技术的研究:首先测定了北太平洋SPH和阿根廷SPH的DPPH自由基清除率(20.38±0.97%和18.49±0.7%),羟基自由基清除率(9.35 ±0.57%和 7.75±0.36%),总抗氧化能力(0.070±0.003 U/mL 和 0.376±0.004 U/mL)和ACE抑制能力(45.93±0.31%和42.03±0.19%)用来评价鱿鱼足SPH的抗氧化活性和ACE抑制活性,实验结果显示北太平洋鱿鱼足的抗氧化活性和ACE抑制活性均高于阿根廷鱿鱼足。然后采用超滤分级和Sephadex G-10凝胶层析柱得到SPH-Ⅲ2对DPPH自由基清除力(DPPH自由基清除率分别为25.86±0.59%和25.95±0.56%)和ACE抑制力(ACE抑制率为75.78±0.63%和75.08±0.71%)最高。经过UPLC测定,确定北太平洋鱿鱼SPH-Ⅲ2和阿根廷鱿鱼足多肽SPH-Ⅲ2的分子量分别为634.84 Da和 637.2 Da。(3)计算机模拟产生北太平洋鱿鱼抗氧化肽和ACE抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptide,ACEIP)的研究:使用植物蛋白酶和脯氨酰内肽酶(prolyloligopeptidase,POP)用于鱿鱼肌球蛋白重链的水解。通过BIOPEP-UWM和ATHpin数据库预测出13种抗氧化肽和126种ACEIP。然后,通过预测毒性,过敏性,胃肠稳定性和肠上皮通透性筛选出2种抗氧化肽和30种ACEIP,其中30种ACEIP包括21种已知肽和9种新肽。此外,通过分子对接评估ACEIP与ACE的相互作用机制。结果表明,ACEIP的新肽中的QY和QM对ACE具有潜在的抑制作用。它们可以通过配位键与Zn(IⅡ)结合,并通过氢键和疏水相互作用深埋在ACE的疏水口袋S1、S2和.S1'中。这项工作表明,.北太平洋鱿鱼是抗氧化肽和ACEIP.的良好来源,也可以用作在计算机中探索食源性抗氧化肽和ACE抑制肽的方案。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TP391.7;TQ936.16
【图文】：

鱿鱼,水解度,种条,木瓜蛋白酶

第二章鱿鱼足多肽制备的工艺优化中，与喊性蛋白酶、中性蛋白酶和膜蛋白酶相比，木瓜蛋白酶具有；在鳕鱼皮蛋白酶解中，木瓜蛋白酶也具有最高的水解度［７４］。且与Ｆａ鱼副产物的酶解实验中得出一致的结果。因此木瓜蛋白酶对大多水较高的水解度，且木瓜蛋白酶价格低，酶活高、热稳定性好、天然卫以，本实验选择木瓜蛋白酶作为水解蛋白酶。逡逑

鱿鱼,水解度,木瓜蛋白酶,种条

．．．．ｊ＾逡逑图２．１不同酶种条件下鱿鱼足的水解度逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋ＤＨ邋ｏｉ邋ｓｑｕｉｄ邋ｔｅｎｔａｃｌｅ邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ逡逑加量对水解度的影响逡逑．２可看出，使用木瓜蛋白酶在相同料液比、酶解温度和时间下，，水解度逐渐提高，当添加量达到１．３％邋（ｗ／ｗ）时，木瓜蛋白酶能力达到最高，随后开始下降。可能是当添酶量继续增大时，出多肽分解为氨基酸而使水解度降低。所以添酶量在１．３％邋（ｗ／ｗ）３０ｎ逡逑

鱿鱼,水解度,酶解

逑２．３．２．３酶解时间对水解度的影响逡逑由图２．３可看出，使用木瓜蛋白酶在相同料液比、酶添加量和酶解温度下，随着逡逑酶解时间的增加水解度逐渐增大，在６ｈ之后，水解度基本没有变化，推测可能此时逡逑酶与底物反应基本完全，达到饱和状态，如果继续酶解可能会出现过度酶解现象。逡逑３０１逡逑＋北太平洋鱿鱼足逡逑＋阿根廷鱿鱼足逡逑２５－逡逑Ｉ２０＇逡逑＾１５－逦＾逡逑４逦５逦６逦７逦８逦９逦１０逡逑时间（ｈ）逡逑图２．３不同时间下鱿鱼足的水解度逡逑Ｆｉｇ．邋２．３邋ＤＨ邋ｏｆ邋ｓｑｕｉｄ邋ｔｅｎｔａｃｌｅ邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ逡逑２．３．２．４液料比对水解度的影响逡逑由图２．４可看出，使用木瓜蛋白酶在相同酶添加量、酶解温度和时间下，随着水逡逑量的增加水解度逐渐增高，在达到３：１邋（ｖ／ｖ）后，水解度开始随着水量的增加开始呈逡逑现平缓下降趋势。推测这可能是因为随着水量的增加，分子运动活度开始提高，酶与逡逑底物反应加快，当水量持续增高时，体系浓度逐渐被稀释，过多的水量也抑制了酶与逡逑底物的反应活度从而抑制了水解反应使水解度降低。因此选择３：１邋（ｖ／ｖ）的液料比较逡逑合适。逡逑２５１逦？＊■北太平洋鱿负足逡逑＋阿根廷鱿＆足逡

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